β-葡萄糖苷酶非水相介质中催化作用的研究

论文摘要

随着糖生物学的发展,糖的各种生物学功能逐渐被认识,糖苷类药物的催化合成成为目前研究的热点。合成糖苷的方法主要是化学合成法,该方法需要多步保护和去保护过程,利用酶催化不仅避免了复杂的过程,同时酶具有立体选择性高、反应条件温和等优点,从而被广泛的采用。β-葡萄糖苷酶,作为一种糖苷水解酶,在具有催化糖苷键水解活性的同时,还具有催化糖基转移的活性。本课题的目的之一就是通过对微生物来源的β-葡萄糖苷酶的固定化,以水溶性的中草药天然成分红景天苷为代表物质,构建一个适合于糖苷类活性物质合成的非水相固定化酶反应体系,从而为中草药中天然活性物质的合成提供了一种新的方法。本课题的目的之二就是利用β-葡萄糖苷酶在反胶束反应体系中合成VE糖苷反应体系的构建。从而为药物的糖基化修饰奠定技术基础。其主要内容如下:（1）采用紫外线-氯化锂复合诱变的方法筛选得到一株LW-6高产菌株,同时利用正交试验的方法,考察了产酶培养基组分如碳源、氮源、无机盐以及表面活性剂对产酶能力的影响,确定了最佳产酶培养基:4%麸皮,0.2%蛋白胨,0.1%（NH4）2SO4,0.1%KH2PO4,0.1%MgSO4,0.1%CaCO3,0.1%醋酸钠,0.1%抗坏血酸,pH自然。（2）选择海藻酸钠/壳聚糖为固定化载体,通过先交联再吸附的方法固定β-葡萄糖苷酶。采用正交试验的方法,确定了最佳的固定化条件:壳聚糖浓度1.5%,吸附时间9h,交联时间12h,戊二醛浓度1.0%,吸附温度0℃,此时,酶活力回收率为74.38%。同时研究了固定化酶的酶学性质,结果表明:固定化酶和游离酶的最适pH值分别为5.8和4.8,最适温度均为50℃,固定化酶与游离酶的米氏常数分别为1.688mmol/L和9.878mmol/L,固定化酶的酸碱稳定性、热稳定性以及储存稳定性均有提高,经过9个循环反应相对酶活仍保持在50%以上,此外,固定化酶对有机溶剂叔丁醇具有很好的耐受性。说明海藻酸钠/壳聚糖固定β-葡萄糖苷酶能够有效提高稳定性和重复使用率。（3）采用高效液相色谱法为检测手段,考察了非水相介质中固定化β-葡萄糖苷酶催化反应的特性,结果表明:催化合成红景天苷的最佳条件为:反应介质pH 5.8醋酸缓冲液/叔丁醇（1:9）,底物浓度酪醇5g/L,D-葡萄糖与酪醇摩尔比为1:1,反应时间50h,反应温度50℃,此时红景天苷的转化率为71.9%,并对其进行了红外、核磁等结构鉴定。（4）采用正交试验的方法,优化了反胶束体系的制备条件,结果表明,AOT/异辛烷反胶束体系制备的最佳条件是:含水量15,缓冲液pH 4.5,温度60℃,表面活性剂浓度50mmol/L,KCL浓度为0.1mol/L。在此基础上催化合成了VE糖苷,并对其进行了红外、核磁等结构鉴定。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.β-葡萄糖苷酶的研究进展
• 1.1 固定β-葡萄糖苷酶的载体和方法
• 1.2 固定化β-葡萄糖苷酶酶学性质的研究
• 1.3 β-葡萄糖苷酶酶催化反应的应用
• 2.反胶束反应体系
• 2.1 非水介质中酶的催化性能
• 2.2 反胶束反应体系应用的研究进展
• 3.红景天苷及VE糖苷的研究进展
• 4.本课题研究的目的和主要内容
• 第二章 β-葡萄糖苷酶高产菌株的诱变选育及产酶培养基的优化
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 诱变筛选结果
• 2.2 葡萄糖标准曲线的制定
• 2.3 单因素影响试验
• 2.4 正交试验分析结果
• 3.小结
• 第三章 壳聚糖/海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶的研究
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 不同载体和固定化方法制备固定化酶的效果比较
• 2.2 单因素试验结果
• 2.3 固定化酶制备条件的优化
• 3.小结
• 第四章 固定化β-葡萄糖苷酶酶学性质的研究
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果与讨论
• 2.1 最适pH值和最适温度的分析
• 2.2 pH稳定性和热稳定性的分析
• 2.3 米氏常数Km的测定
• 2.4 贮存稳定性分析
• 2.5 固定化酶对有机溶剂耐受性的测定
• 2.6 固定化酶操作稳定性的分析
• 3.小结
• 第五章 固定化β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷及结构表征
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果与讨论
• 2.1 红景天苷标准曲线的制定
• 2.2 固定化β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷条件的选择
• 2.3 红景天苷的结构鉴定
• 3.小结
• 第六章 反胶束体系中β-葡萄糖苷酶催化合成VE糖苷
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果与分析
• 2.1 反胶束体系中葡萄糖标准曲线的制定
• 2.2 单因素试验结果
• 2.3 正交试验结果
• 2.4 VE糖苷结构的鉴定
• 3.小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介