论文摘要
心脏节律的形成和维持依赖于起搏细胞动作电位4相自动除极化。在动作电位（AP）结束时,心脏起搏细胞去极化使膜电位逐渐增高接近新动作电位启动的阈值,产生周而复始的电活动。作为组织自动除极最主要电流之一,起搏电流（pace maker current,If）无论在自律细胞的起搏[1],还是工作肌细胞异位节律增高方面均起着关键性作用。编码If通道的基因家族在鼠和人类已经被克隆[2,3],分别是HCN1～HCN4,超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN）基因是心脏正常起搏活动至关重要的分子基础,起博电流表现为广泛的区域电压依赖性,心脏主要表达HCN2和HCN4[4],在窦房结HCN含量最高的是HCN4占绝对优势的亚型,占总HCN mRNA的80%以上[5,6,7]。本研究旨在创新性的建立系统、简单、适用异源性表达系统,利用全细胞膜片钳技术研究克隆HCN4亚型电生理的特征,明确它对起搏电流（If）的贡献,探讨起搏电流与老年阵发性房颤（PAF）异位起源点的内在联系,揭示If在老年PAF启动中的作用。本课题的目的在于寻找老年PAF起源点产生的机制,为从源头阻断老年PAF奠定理论基础,并为以后药物干预提供新靶点,对于提高老年PAF治愈率,降低病死率将有重要的实用价值。本研究包括以下三个章节,分述如下:第一章起搏通道HCN4质粒的构建及鉴定目的构建HCN4基因和携带绿色荧光蛋白基因（GFP）标记的质粒表达载体pTracer-HCN4-GFP。方法回收质粒DNA片段与载体连接,重组质粒经转化、筛选、提取、鉴定后进行序列测定。同时质粒经双酶切鉴定为目的基因片段。结果成功构建pTracer-HCN4真核表达载体。结论通过酶切鉴定和测序得到证实,起搏通道HCN4基因转入质粒pTracer-CMV2。第二章起搏通道HCN4质粒的转染HEK293细胞进行蛋白mRNA表达目的观察起搏通道HCN4质粒经脂质体瞬时转染细胞进行蛋白表达。方法HCN4质粒在传代培养的HEK293细胞中瞬时转染,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染细胞HCN4基因表达。结果1.在HEK293细胞中脂质体介导mHCN4基因转染成功。2.瞬时转染mHCN4后6～8h,荧光显微镜观察:可见转染细胞的胞核和胞浆区均有GFP表达,发出明亮的绿光;细胞核内表达明显,细胞膜表达为主,核周区也有表达。3.采用RT-PCR方法,扩增出HCN4片段,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析观察到与预期大小一致的DNA片段。结论脂质体转染后24h,RT-PCR方法和绿色荧光标记基因检测到目的基因及其蛋白的表达,转染后48h较24h蛋白表达有增加的趋势。第三章HCN4质粒在HEK293细胞异源性表达后的电流记录目的观察应用含目的基因HCN4和携带绿色荧光蛋白基因（GFP）标记的质粒表达载体pTracer-HCN4-GFP进行共转染,结合全细胞膜片钳技术记录转染细胞后mHCN4通道电流的特征。方法瞬时转染HEK293细胞行全细胞膜片钳记录。结果记录到一系列超极化内向离子流,该电流呈电压、时间依赖性,没有明显的失活,在-150mV时电流幅值为（540±24.1）pA,半最大激活电位（V1/2）为（-105.7±12.0）mV,稳态激活曲线斜率（k）为-15.7mV,HCN4电流翻转电位为（-84.0±7.9）mV。结论（1）成功构建起搏通道HCN4基因的细胞模型。（2）转染mHCN4基因的HEK293细胞在全细胞膜片钳记录到超极化阳离子电流,加入2mmol/LCsCl后电流几乎完全被阻断提示HCN4质粒转染HEK293细胞不仅有蛋白表达,而且具有起搏通道的功能。