论文题目: 原发性肾病综合征激素耐药机制探讨——NPHS2基因及NR3C1基因的检测和分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 儿科学
作者: 余自华
导师: 陈新民,丁洁
关键词: 肾病综合征,激素耐药,中国人,细胞表面表达,基因多态性,单倍体
文献来源: 第一军医大学
发表年度: 2005
论文摘要: 第一部分 家族性激素耐药型肾病综合征家系NPHS2基因的分析 目的 原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)是儿童最常见的肾小球疾病,临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症和不同程度的浮肿。大部分PNS患儿对激素敏感,预后良好;然而,10%～20%PNS患儿对激素耐药,大部分将逐渐进展到终末肾。近年来,关于肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)激素耐药的发生机制研究在单基因突变引起激素耐药型肾病综合征(steroid-resistant nephrotic syndrome,SRNS)方面取得了突破性进展,如常染色体隐性遗传型SRNS由新近认识的NPHS2基因突变引起。NPHS2基因编码蛋白podocin是一个含有383个氨基酸的“发夹样”完整膜蛋白,第105～121位氨基酸为膜区,氨基端(第1～104位氨基酸)和羧基端(第122～383位氨基酸)均在细胞质中,定位在足细胞裂孔隔膜区,是维持肾小球正常滤过功能的关键分子之一。由NPHS2基因突变引起家族性SRNS在我国尚未见报道。中国汉族人家族性SRNS是否存在NPHS2基因突变及其特点均不清楚。本研究通过对一个中国汉族人家族性SRNS家系NPHS2基因突变的检测,旨在分析中国汉族人家族性SRNS家系NPHS2基因及其突变特点。方法 研究对象为一个汉族人家族性SRNS家系中的先证者(9个月女孩)及其兄(9岁半死于
论文目录:
摘要
ABSTRACT
前言
1 家族性激素耐药型肾病综合征家系NPHS2基因的分析
1.1 实验材料
1.1.1 研究对象
1.1.2 标本收集
1.1.3 引物设计
1.1.4 主要仪器
1.1.5 主要药品、试剂及其配制
1.2 方法
1.2.1 肾组织间接免疫荧光染色
1.2.2 基因组DNA的提取与定量
1.2.3 PCR扩增NPHS2基因8个外显子
1.2.4 DHPLC分析
1.2.5 DNA序列测定
1.3 结果
1.3.1 肾脏病理及常规免疫病理
1.3.2 先证者肾组织中podocin、nephrin、alpha-actinin-4和WT1的表达
1.3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定
1.3.4 DHPLC检测条件的建立
1.3.5 DHPLC分析结果
1.3.6 DNA测序结果
1.4 讨论
1.5 小结
2 散发性激素耐药型肾病综合征患儿NPHS2基因的分析
2.1 实验材料
2.1.1 研究对象
2.1.2 引物设计
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要药品、试剂及其配制
2.2 方法
2.2.1 基因组DNA的提取与定量
2.2.2 PCR扩增NPHS2基因8个外显子
2.2.3 DHPLC分析
2.2.4 DNA序列测定
2.2.5 统计学分析
2.3 结果
2.3.1 23例散发性SRNS患儿的临床资料
2.3.2 DHPLC分析结果
2.3.3 DNA测序结果
2.3.4 基因型和等位基因频率
2.4 讨论
2.5 小结
3 突变NPHS2基因在真核细胞中的表达
3.1 实验材料
3.1.1 研究对象
3.1.2 主要试剂及试剂盒
3.1.3 主要仪器
3.1.4 主要液体配制
3.2 方法
3.2.1 构建含有野生型NPHS2基因编码区全长cDNA的克隆载体
3.2.2 分别构建含有NPHS2基因467_468insT突变cDNA和503G＞A突变cDNA的克隆载体
3.2.3 分别构建含有野生型NPHS2基因cDNA、467_468insT突变cDNA和503G＞A突变cDNA的表达载体
3.2.4 质粒DNA的大量制备
3.2.5 转染HEK293细胞
3.2.6 应用间接免疫荧光染色，用共聚焦显微镜观察podocin的荧光强度及其在细胞内的定位
3.3 结果
3.3.1 从正常肾组织中提取总RNA结果
3.3.2 PCR扩增NPHS2基因编码区全长cDNA结果
3.3.3 构建分别含有野生型NPHS2基因全长编码区cDNA、467_468insT突变cDNA和503G＞A突变cDNA的克隆载体结果
3.3.4 构建分别含有野生型NPHS2基因全长编码区cDNA、467_468insT突变cDNA和503G＞A突变cDNA的表达载体结果
3.3.5 大量制备质粒DNA结果
3.3.6 HEK293细胞podocin免疫荧光双标记染色结果
3.4 讨论
3.5 小结
4 激素耐药型肾病综合征儿童糖皮质激素受体基因的检测和分析
4.1 实验材料
4.1.1 研究对象
4.1.2 引物
4.1.3 主要仪器
4.1.4 主要药品、试剂及其配制
4.2 方法
4.2.1 基因组DNA的提取与定量
4.2.2 分离外周血淋巴细胞
4.2.3 从外周血淋巴细胞中提取总RNA
4.2.4 PCR扩增NR3C1基因片段
4.2.5 PCR扩增NR3C1基因alpha-cDNA、beta-cDNA和ACTB基因cDNA及RT-PCR产物的鉴定
4.2.6 DHPLC分析
4.2.7 DNA序列测定
4.2.8 统计学分析
4.3 结果
4.3.1 NS患儿临床资料
4.3.2 从外周血淋巴细胞提取总RNA
4.3.3 RT-PCR结果
4.3.4 DHPLC分析结果
4.3.5 DNA测序结果
4.3.6 NR3C1基因单倍体3和单倍体5的等位基因频率
4.4 讨论
4.5 小结
参考文献
附录
成果
综述
致谢
原创性声明及版权使用授权书
发布时间: 2006-01-06
参考文献
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