论文摘要
环境中存在着大量人工合成的化学物,这些人类创新产物中的一部分可能会干扰人体内分泌系统的正常的功能,导致生殖内分泌系统肿瘤,不孕不育,甚至会影响到人类的生存繁衍,他们属于环境内分泌二扰物（EEDs）。本研究旨在通过建立核受体介导的in vitro报告基因试验方法（也称为转录激活试验）,来研究这些环境化学物对雌激素受体（ER）、雄激素受体（AR）和甲状腺激素受体（TR）功能的干扰作用。受体报告基因试验是以受体介导理论为基础,应用基因重组技术,将报告基因置于外源性激素反应元件（HRE）的调控之下,构建重组报告基因载体,应用基因转染技术导入真核细胞内,通过检测化学物作用下报告基因编码的酶活性或蛋白表达的变化,间接反映内源性基因的表达情况。这种方法既可检测化学物与受体的结合能力,又可检测结合后引起的生物学效应,而且能够区分激动剂和拮抗剂,与受体结合试验相比可提供更多的信息,因此成为EEDs筛选的有力工具。针对ER、AR和TR三种不同的核受体,我们的研究分为三个部分,分别构建了相应的HRE调控的报告基因质粒,用来瞬时或者稳定转染不同的哺乳动物细胞,并且研究了环境化学物通过核受体介导的内分泌干扰效应。第一部分环境化学物雌激素干扰效应研究目的以虫荧光素酶（Luc）为报告基因,采用瞬时和稳定转染的方法建立ER介导的转录激活试验方法,为化学物拟/抗雌激素活性的检测提供研究工具。应用建立的方法评价烷基酚类（APs）、双酚A（BPA）、苯基苯酚等结构类似物和一些饮用水水源水样本的雌激素活性。方法1.将表达大鼠ERα的质粒rERα/pCI与重组Luc报告基因质粒pERE-aug-Luc、对照质粒phRL-tk共转染CV-1细胞,建立rERα介导的报告基因试验。以雌二醇（E2）为阳性对照检测方法的筛选效率。CV-1细胞转染后用受试化学物染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的ER激动作用。2.将表达人ERα配体结合域和Gal4-BD（酵母转录因子结合域）融合蛋白的质粒pGal4-ERαdef与Gal4反应的报告基因质粒pUAS-tk-luc、对照质粒phRL-tk分别共转染MCF-7细胞,建立ER介导的报告基因试验。以E2为阳性对照检测方法的筛选效率。MCF-7细胞转染后用受试化学物染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的ER激动作用。根据该物质能否拮抗E2诱导的Luc表达,判断化学物的ER拮抗作用。3.采用稳定转染了pVit-tk-Luc质粒的MVLN细胞,接种到96孔板,染毒受试化学物,检测Luc的表达来研究化学物的拟雌激素活性。结果1.rERα报告基因试验方法的实际最低检测限为1010M E2,10-7M达最大值,诱导倍数为溶剂对照的25.9倍,随着E2染毒剂量的增加,在10-7M E2浓度后,Luc的表达量维持在较高的平台水平,EC50为4.7nM。E2对Luc诱导作用在组内变异系数（CV）为7.8%,组间CV为12.6%。2.hERα报告基因试验方法的实际最低检测限为0.5×10-10M E2,10-9M达最大值,诱导倍数为溶剂对照的17.9倍,随着E2染毒剂量的加大,在10-9M E2浓度后,Luc的量维持在较高的平台水平。EC50为0.16nM。组内CV为6.7%,组间CV为12.8%。3.采用hERα介导的报告系统研究BPA、苯基苯酚和APs等化学物的拟雌激素活性,试验结果表明,随着取代基上碳原子数目从3增加到8,烷基酚及其结构类似化合物诱导Luc表达的能力也在逐步增加,但是所有受试物的拟雌激素活性均远远低于E2。采用rERα介导的报告系统取得相似的结果,受试化学物的雌激素活性大小是4。丙基酚＜4-丁基酚＜4-戊基酚＜4-苯基苯酚＜4-辛基酚＜BPA。4.采用rERα报告基因系统研究饮用水源地采取的水样品的雌激素干扰活性,结果两个采样点的水样的200倍浓缩品均显示出拟雌激素的活性。5.0.5pM浓度的E2开始诱导MVLN细胞表达Luc,而到了50pM达到最高效应,最大诱导倍数为溶剂对照的4倍。结论1.本研究建立的ER报告基因试验具有较高的灵敏度和重复性。E@对Luc的诱导是ER依赖性,并呈剂量-效应关系。以上结果表明本研究建立的方法能够有效地筛选ER激动剂和拮抗剂,可作为化学物（抗）雌激素活性筛选的理想模型。2.所研究的APs和BPA等化学物具有拟雌激素活性,其活性随着取代基大小的增加而增强。而且,体外筛选试验所采用的细胞系类型和ER的种属不影响APs及其类似物的雌激素活性的检测。3.所检测的饮用水水源水样本具有拟雌激素活性的能力。4.稳定转染pVit-tk-Luc质粒的MVLN细胞株能用来研究化学物雌激素干扰活性。第二部分环境化学物雄激素干扰效应研究目的采用瞬时和稳定转染方法,建立AR介导的Luc报告基因试验,为化学物拟/抗雄激素活性的检测提供研究工具。应用建立的方法研究一些常用农药和化学物的雄激素干扰活性。方法1.合成含四个ARE和一个TATA启动子的小鼠乳腺癌病毒长末端重复序列（MMTV-ETR）,定向插入报告基因质粒pGL3-basic的多克隆位点内切酶KpnⅠ和BglⅡ之间,构建受ARE调控的Luc报告基因质粒pMMTV-Luc。将该质粒与表达AR的质粒AR/pcDNA3.1和阳性对照质粒phRL-tk共转染CV-1,建立AR报告基因试验。以5α-双氢睾酮（5α-DHT）为阳性对照检测该方法的筛选效率。CV-1转染后用受试化学物染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的AR激动作用;根据该物质能否拮抗5α-DHT诱导的Luc表达,判断化学物的AR拮抗作用。2.应用稳定转染了pMMTV-Luc质粒的MDA-kb2细胞,接种到96孔板上,单独或者与DHT共同染毒受试化学物,检测Luc表达研究化学物拟/抗雄激素作用。结果1.本方法的最低检测限为10-10M 5α-DHT。5α-DHT对Luc诱导作用的组内CV为8.9%,组间CV为13.1%。对只转染pMMTV-Luc和phRL-tk而不转染AR/pcDNA3.1的CV-1染毒,5α-DHT不诱导Luc的表达。5α-DHT对共转染三种质粒的CV-1的诱导作用表现为:10-10M的5α-DHT显著诱导Luc的表达,10-7M时达最大值,诱导倍数为61.83,随着5α-DHT染毒剂量的加大,在10-7M-10-6M范围内Luc的表达量维持在较高的平台水平,计算其半数效应浓度EC50为3.65 nM。糖皮质激素受体（GR）激动剂地塞米松（dexamethasone）不诱导Luc的表达。AR拮抗剂尼鲁他明（nilutamide）和氟鲁他明（flutamide）在10-7M-10-5M浓度范围内显著拮抗1nM的5α-DHT诱导的Luc的表达,其半数抑制浓度(IC50)分别为4.05μM和3.49μM。2.在对农药的AR激动作用进行检测时发现氰戊菊酯（Fen）、氯氰菊酯（Cyp）、氯菊酯（Per）以及3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）对Luc没有明显的诱导作用。在进行AR拮抗作用检测时发现:Fen、Cyp、Fer以及3-PBA在10-4M的浓度均能显著拮抗1nM的5α-DHT诱导的Luc的表达。IC50分别为0.37mM、0.42mM、0.43mM和1.21mM。3.双酚A（BPA）、四氯双酚A（TCBPA）和五氯酚（PCP）单独染毒不能的诱导Luc表达。PCP不能拮抗1nM浓度的5α-DHT诱导的Luc的表达。BPA的浓度为10-7M时对5α-DHT无明显的拮抗作用,随着染毒浓度的加大,在10-6M和10-5M时能拮抗1 nM 5α-DHT诱导的Luc的表达,差异有显著性,其IC50为2.14μM。10-5M浓度的TCB能够显著性抑制1nM 5α-DHT诱导的Luc表达,其IC50为10.45μM。4.10-10M DHT开始诱导MDA-kb2细胞系表达Luc,而到10-8M浓度时,作用达到平台期,诱导倍数为对照的9倍左右。结论1.本研究建立的AR报告基因试验具有较高的灵敏度和重复性。5α-DHT对Luc的诱导是AR依赖性,并呈剂量-效应关系。该方法不存在与GR激动剂地塞米松的交叉反应,具有较高的特异性。本方法能够检出AR拮抗剂尼鲁他明和氟鲁他明对5α-DHT作用的拮抗作用。以上结果提示本研究建立的方法能够有效地筛选AR激动剂和拮抗剂,可作为化学物（抗）雄激素活性筛选的理想模型。2.Fen、Cyp、Per和3-PBA无AR激动作用,但他们都能拮抗雄激素的功能。3.BPA、TCBPA和PCP无AR激动作用;BPA和TCBPA能拮抗雄激素功能;PCP未表现出对雄激素的拮抗作用。4.稳定转染了pMMTV-Luc质粒的MDA-kb2细胞株能够用来研究化学物雄激素干扰活性。第三部分环境化学物甲状腺激素干扰效应研究目的建立瞬时转染的TR介导的Luc报告基因试验体系,以及对甲状腺激素反应的GH3细胞增殖试验,为化学物拟/抗甲状腺激素活性的检测提供研究工具。应用建立的方法研究一些常用农药和化学物的甲状腺激素干扰活性。方法1.采用无血清的PCM培养基配方培养GH3细胞,在2500细胞/孔的密度种植到96孔板中,检测T3和受试化学物对细胞增殖的影响。2.将表达人甲状腺激素受体的质粒pCMX-hTRβ和含甲状腺激素反应元件DR4的重组报告基因质粒pDR4-tk-CAT以及内参pSV-β-Gal共同转染到CV-1细胞内,建立hTRβ介导的报告基因试验方法。以T3作为阳性对照来检测方法的筛选效率。CV-1细胞转染后用受试化学物染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的TR激动作用,根据该物质能否拮抗T3诱导的Luc表达,判断化学物的TR拮抗作用。3.将表达人TRβ配体结合域和Gal4-BD（酵母转录因子结合域）融合蛋白的质粒pGal4-L-TRβ与Gal4反应的报告基因质粒pUAS-tk-luc、对照质粒phRL-tk共转染HepG2细胞,建立TR介导的报告基因试验,以T3为阳性对照检测方法的筛选效率。CV-1细胞转染后用受试化学物染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的TR激动作用。根据该物质能否拮抗T3诱导的Luc表达,判断化学物的TR拮抗作用。结果1.1nM浓度的T3能够诱导相对于溶剂对照3倍的GH3细胞的表达。OH-PCB106和1nM T3共同染毒GH3细胞,结果表明:OH-PCB106在10-9M以上浓度时,能够抑制1nM T3诱导的GH3细胞的增殖2.采用CAT报告基因研究OH-PCB106抗甲状腺激素作用时,10nM T3能够诱导3倍于对照的CAT的表达。10-11M浓度的OH-PCB106就能够抑制10nM T3对CAT活性的诱导,随着PCB浓度的增加,这种抑制作用的增加不是很明显,直到增加到10-5M浓度,才与10-11M出现显著性下降。3.TR介导的Luc报告基因试验的最低检测限为10-11M T3,10-8M时达最大值,诱导倍数为7.85,随着T3染毒剂量的加大,在10-8M-10-6M范围内Luc的表达量维持在较高的平台水平,计算其半数效应浓度EC50为0.46nM。采用48孔板,10-9M的T3对Luc诱导作用组内变异系数为5.9%,组间的变异系数11.7%。4.农药甲萘成和它的代谢产物1-萘酚以及结构类似物2-萘酚三种受试物在10-4M及以下浓度时,都不能诱导Luc表达,而三者在10-5M及以上浓度都可以不同程度抑制5nM T3诱导的报告基因表达,IC50分别为8.40×10-5M,7.62×10-5M和7.73×10-5M。结论1.在体外,OH-PCB106具有抑制甲状腺激素活性能力。2.本研究建立的TR介导Luc报告基因试验具有较高的灵敏度和重复性,能够有效地筛选AR激动剂和拮抗剂,可作为化学物（抗）甲状腺激素活性筛选的理想模型。3.甲萘威、1-萘酚和2-萘酚能够拮抗T3的功能。
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