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栉孔扇贝关键模式识别受体介导的免疫应答机制研究

2020-12-11阅读(1023)

栉孔扇贝关键模式识别受体介导的免疫应答机制研究

论文摘要

栉孔扇贝（Chlamys farreri）是我国海水养殖的重要品种之一,其养殖产业对推动我国沿海经济发展发挥巨大作用。但自上世纪九十年代以来,养殖扇贝陆续爆发大规模死亡现象,不但造成了巨大的经济损失,而且严重威胁到了现有产业的可持续发展。从机体的免疫系统着手,深入研究扇贝的免疫防御机制,探讨提高抗病力的有效途径和方法,改良种质并培育抗病品系,是保持扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。模式识别受体介导的免疫识别作用是无脊椎动物固有免疫实现有效防御的关键环节。然而目前对软体动物中模式识别受体介导的免疫识别作用和免疫应答反应的研究仅处于起步阶段,许多相关机制尚不明了。本研究采用分子生物学和免疫学技术,对栉孔扇贝单结构域C型凝集素（CfLec-1和CfLec-2）、多结构域C型凝集素（CfLec-3）、肽聚糖识别蛋白（CfPGRP-S1）及脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白（CfLGBP）等模式识别受体介导的免疫识别和免疫应答反应的机制展开研究,以期深入了解扇贝的免疫防御机制。利用荧光定量PCR检测了CfLec-1和CfLec-2在栉孔扇贝受到病原相关分子模式（PAMP）刺激后的应答规律,发现LPS和β-glucan可以显著诱导CfLec-1mRNA的表达,PGN的刺激则显著性降低了CfLec-1mRNA的表达,而LPS、PGN和β-glucan的刺激均可以显著性诱导CfLec-2mRNA的表达;重组蛋白rCfLec-1和rCfLec-2在体外均可以结合LPS、PGN和mannan,此外rCfLec-2还可以结合zymosan,表明CfLec-1和CfLec-2均可以介导栉孔扇贝对PAMPs的免疫识别作用,且具有不同的识别特异性。免疫荧光分析显示CfLec-1和CfLec-2蛋白具有不同的组织分布特异性,CfLec-1在外套膜和鳃中特异性表达,而CfLec-2在外套膜、肾脏和性腺中表达。虽然CfLec-1和CfLec-2是分泌型蛋白,它们都能够结合到栉孔扇贝血细胞表面,且这种结合可以促进栉孔扇贝血细胞对琼脂糖颗粒的包囊化作用,说明CfLec-1和CfLec-2通过其不同的PAMP的识别与结合能力,完成对不同病原微生物的识别作用,并介导扇贝血细胞对病原微生物的包囊化作用,从而参与扇贝的免疫应答反应。多结构域C型凝集素CfLec-3对LPS、PGN和β-glucan等PAMP的刺激均呈现显著性上调表达。CfLec-3和它3个糖识别结构域（CRD）的重组蛋白均具有PAMP结合活性,CfLec-3能够结合LPS、PGN、Yeast glucan、β-1,3-glucan、mannan和CpG ODN等,且CRD1是其PAMP结合活性的主要贡献者。免疫组织化学分析显示CfLec-3蛋白具有组织分布的广泛性,其在肝胰腺、鳃、肾、外套膜和肌肉等组织中特异性表达,此外CfLec-3在分泌到细胞外后可以结合到血细胞表面。rCfLec-3和3个rCRD均可以促进栉孔扇贝血细胞的免疫应答反应,包括对琼脂糖颗粒的包囊化作用和对大肠杆菌的吞噬作用,且CRD2和CRD3是CfLec-3对血细胞免疫应答反应促进作用的主要贡献者。可见CfLec-3中3个CRD之间发生了显著性的功能分化,CRD1主要负责PAMP的识别与结合,而CRD2和CRD3主要负责介导免疫应答反应。对3个CRD三级结构的预测显示CRD2和CRD3具有相似的三级结构,而CRD1与二者的结构差异较大,推测三级结构的显著差异是造成CfLec-3中3个CRD发生功能分化的主要原因。以钙离子结合位点2为目标,对3个CRD进行定点突变分析,并检测了8个突变体CRD的PAMP结合活性,分析结果显示CRD的PAMP结合活性具有氨基酸水平的特异性,其中钙离子结合位点2中的“Pro”对于PAMP结合活性是必不可少的,“Asn”是决定其对甘露聚糖结合特异性的位点,而CRD1中的“YPT”基序与其广谱性的PAMP结合能力直接相关。CfPGRP-S1对PGN的刺激呈现剧烈的上调表达,而对LPS和β-glucan的刺激呈现微弱的上调表达;重组蛋白rCfPGRP-S1可以结合PGN,且在高浓度时能够结合LPS;rCfPGRP-S1对PAMPs的识别进一步介导了其对革兰氏阳性菌藤黄微球菌、枯草杆菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌等微生物的凝集作用,表明CfPGRP-S1可以作为模式识别受体参与栉孔扇贝对病原微生物的免疫识别与免疫应答作用。rCfPGRP-S1具有Zn2+依赖的酰胺酶活性,可以水解PGN中的肽键从而清除PGN;同时rCfPGRP-S1对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌具有显著性的抑制与杀灭作用,且这种抑菌杀菌作用可能与酰胺酶活性相关。CfLGBP对LPS和β-glucan的刺激呈现剧烈的上调表达,而对PGN的刺激呈现微弱的上调表达;重组蛋白rCfLGBP不仅可以结合LPS和β-glucan,而且在高浓度时能够结合PGN;这种广谱的PAMP结合活性赋予了CfLGBP广谱的凝菌活性,其对革兰氏阴性菌大肠杆菌、革兰氏阳性菌枯草杆菌和真菌毕赤酵母均具有凝集活性。综上所述,本论文系统的研究了栉孔扇贝3类5种模式识别受体介导的免疫识别作用和免疫应答反应的机制。该研究结果为进一步探讨无脊椎动物尤其是软体动物的免疫应答机制提供了依据,同时也为丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学内容提供了理论基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 第一节 无脊椎动物的固有免疫系统
  • 一、非己的识别
  • 1. 模式识别理论
  • 2. 病原相关分子模式
  • 3. 模式识别受体
  • 二、免疫信号的调整和放大
  • 1. Toll/dif 途径
  • 2. Imd/Rrelish 途径
  • 三、病原体的清除
  • 1. 细胞免疫
  • 2. 体液免疫
  • 第二节 模式识别受体概述
  • 一、C 型凝集素
  • 1.C 型凝集素的结构
  • 2.C 型凝集素的分类
  • 3.C 型凝集素的功能
  • 二、肽聚糖识别蛋白
  • 1. 肽聚糖识别蛋白的结构与分类
  • 2. 肽聚糖识别蛋白的功能
  • 三、脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白
  • 四、其他模式识别受体
  • 1.T oll 样受体
  • 2. 硫依赖型凝集素
  • 3. 清道夫受体
  • 4. 含硫酯蛋白
  • 第三节 海洋无脊椎动物模式识别受体研究进展
  • 一、C 型凝集素
  • 二、肽聚糖识别蛋白
  • 三、脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白
  • 四、其他模式识别受体
  • 第四节 本研究的目的和意义
  • 第二章 实验材料与方法
  • 第一节 实验材料
  • 一、实验动物与菌株
  • 二、主要试剂
  • 三、主要仪器
  • 第二节 实验方法
  • 一、序列与结构特征分析
  • 二、栉孔扇贝cDNA 模板的制备
  • 1. 扇贝的PAMPs 免疫刺激
  • 2. 扇贝总RNA 的提取
  • 3. 扇贝cDNA 模板第一链的合成
  • 三、荧光实时定量PCR
  • 四、蛋白的原核重组表达和纯化
  • 1. 质粒的提取
  • 2. 重组质粒的构建
  • 3. 重组蛋白的表达与检测
  • 4. 重组蛋白的纯化
  • 5. 重组蛋白的复性与浓度测定
  • 五、定点突变分析
  • 1. 定点突变
  • 2. 突变体蛋白的重组表达
  • 六、多克隆抗体的制备与Cy3 标记
  • 1. 多克隆抗体的制备
  • 2. 多克隆抗体特异性的检测
  • 3. 多克隆抗体的纯化与Cy3 标记
  • 七、免疫荧光分析
  • 1. 组织材料处理
  • 2. 免疫荧光染色
  • 八、免疫组织化学分析
  • 1. 组织材料处理
  • 2. 免疫组织化学染色
  • 九、重组蛋白的PAMPs 结合活性分析
  • 1. PAMPs 生物芯片法
  • 2. 酶联免疫吸附（ELISA）法
  • 十、重组蛋白对扇贝血细胞体外吞噬与包囊化作用的促进
  • 1. 吞噬作用
  • 2. 包囊化作用
  • 十一、重组蛋白的凝菌活性分析
  • 十二、重组蛋白的抑菌活性分析
  • 十三、重组蛋白的酰胺酶活性分析
  • 第三章 实验结果与讨论
  • 第一节 栉孔扇贝单结构域C 型凝集素的免疫应答机制
  • 一、实验结果
  • 1. CfLec-1 和CfLec-2 对PAMPs 刺激的响应
  • 2. CfLec-1 和CfLec-2 重组蛋白的制备
  • 3. CfLec-1 和CfLec-2 多克隆抗体的制备
  • 4. CfLec-1 和CfLec-2 蛋白在组织中的分布
  • 5. CfLec-1 和CfLec-2 的PAMPs 结合活性
  • 6. CfLec-1 和CfLec-2 对栉孔扇贝血细胞包囊化作用的促进
  • 二、讨论
  • 第二节 栉孔扇贝多结构域C 型凝集素的免疫应答机制
  • 一、实验结果
  • 1. CfLec-3 对PAMPs 刺激的响应
  • 2. CfLec-3 及其3 个CRD 重组蛋白的制备
  • 3. CfLec-3 多克隆抗体的制备与Cy3 标记
  • 4. CfLec-3 及其3 个CRD 的PAMPs 结合活性
  • 5. CfLec-3 的免疫组织化学分析
  • 6. CfLec-3 及其3 个CRD 对栉孔扇贝血细胞包囊化作用的促进
  • 7. CfLec-3 及其3 个CRD 对栉孔扇贝血细胞吞噬作用的促进
  • 8. CfLec-3 中3 个CRD 的序列与结构特征
  • 9. CfLec-3 的定点突变分析
  • 10. 突变体CRD 的PAMPs 结合活性
  • 二、讨论
  • 第三节 栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白的免疫应答机制
  • 一、实验结果
  • 1. CfPGRP-51 对PAMPs 刺激的响应
  • 2. CfPGRP-51 重组蛋白的制备
  • 3. CfPGRP-51 多克隆抗体的制备
  • 4. CfPGRP-51 蛋白在组织中的分布
  • 5. CfPGRP-51 的PAMPs 结合活性
  • 6. CfPGRP-51 的凝菌活性
  • 7. CfPGRP-51 的抑菌活性
  • 8. CfPGRP-51 的酰胺酶活性
  • 二、讨论
  • 第四节 栉孔扇贝脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白的免疫应答机制
  • 一、实验结果
  • 1. CfLGBP 对PAMPs 刺激的响应
  • 2. CfLGBP 重组蛋白的制备
  • 3. CfLGBP 多克隆抗体的制备
  • 4. CfLGBP 蛋白在组织中的分布
  • 5. CfLGBP 的PAMPs 结合活性
  • 6. CfLGBP 的凝菌活性
  • 二、讨论
  • 第四章 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 博士期间发表和完成的论文
  • 致谢

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