新型自旋捕捉剂的自旋捕捉性能及其体外抗癌活性的研究

论文摘要

自由基是一种反应活性很强的物质,它在自然界以及人体内广泛存在,同时也在人体的生化活动中扮演极为重要的角色。一方面自由基对人体产生损害,研究表明,自由基与多种疾病与损伤有关,如缺血-再灌注损伤,炎症,癌症和心血管疾病等,另一方面,适当浓度的自由基在人体内又是必要的,因此研究人体内自由基的性质和作用是一项具有重大意义的课题。自旋捕捉是一项将活泼自由基稳定住并通过ESR手段加以检测的技术,自旋捕捉剂不仅能够捕获并检测体内自由基,同时还对体内自由基有一定干预作用。PBN是一类研究得比较早的硝酮类自由基,大量研究表明PBN有一定的药物活性并有一定的抗肿瘤活性。本论文的研究内容总体分为四个部分：第一部分合成了PBN、靶向定位于线粒体的MitoPBN、以及带胆固醇基团的PBN （ChPBN）,新化合物ChPBN的结构通过核磁共振氢谱,核磁共振碳谱,红外光谱进行了表征,第二部分是ChPBN的ESR研究,考察了ChPBN对体外OH、·CH（OH）Me、·CH2OH、·CH（OH）Et、·C（OH）Me等自由基的捕捉情况,第三部分通过薄膜-超声法将ChPBN制备成了高包封率的脂质体,第四部分考察了PBN、MitoPBN、ChPBN及其脂质体的肿瘤细胞毒性。第二部分研究了ChPBN体外捕捉·OH及碳中心自由基,自由基由Fenton反应引发,发现ChPBN和PBN一样,具有较强的羟基捕捉能力,其捕捉各种自由基的能力依此为·OH3>· CH（OH）Me>· CH2OH>· CH（OH）Et>· C（OH）Me。第三部分系统的研究了自旋捕捉剂ChPBN脂质体的制备工艺。在单因素考察的基础上进行正交设计,以包封率为评价指标,优化出制备脂质体的相对最佳条件。按优化处方制得的脂质体的包封率较高；反相高效液相法测定PBN脂质体的含量和包封率,操作简便,准确。第四部分用MTT法研究了PBN、MitoPBN、ChPBN及其脂质体的体外肿瘤细胞毒性,发现这几种药物对癌细胞毒活性大小顺序依次为：MitoPBN>ChPBN脂质体>ChPBN>PBN。这一实验结果的可能解释是：1, MitoPBN定位于自由基的来源地线粒体,最有效干预了体内自由基浓度,故其细胞毒性最大。2,ChPBN上的胆固醇基团增强了药物的生物相容性,使药物更易进入细胞内并干预其中自由基,故毒性大于无胆固醇基团的PBN。3,脂质体更进一步增强其生物相容性,其细胞毒性也相应增加。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 ESR原理
• 1.3 自旋捕捉剂的发展
• 1.3.1 自旋捕捉技术
• 1.3.2 自旋捕捉剂的分类
• 1.3.2.1 亚硝基类
• 1.3.2.2 直链硝酮
• 1.3.2.3 环状硝酮
• 1.3.3 靶向定位于线粒体的自旋捕捉剂
• 1.3.4 PBN用作药物
• 1.3.5 PBN及其衍生物的抗肿瘤活性
• 1.4 研究课题的提出
• 第二章 自旋捕捉剂的合成
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 仪器
• 2.2 PBN的合成
• 2.2.1 2-甲基-2-硝基丙烷的合成
• 2.2.2 锌粉的活化
• 2.2.3 硝酮的合成
• 2.3 MitoPBN的合成
• 2.3.1 4-（4-bromobutoxy）benzal dehyde的合成
• 2.3.2 N-（4-（4-bromobutoxy）benzylidene）-2-methylpropan-2-nitrone的合成
• 2.3.3 MitoPBN的合成
• 2.4 ChPBN的合成
• 2.4.1 对甲酰基苯甲酰氯的合成
• 2.4.2 对甲酰基苯甲酸胆固醇酯的合成
• 2.4.3 ChPBN的合成
• 2.5 讨论
• 2.5.1 合成方法讨论
• 2.5.2 化合物的表征及解析
• 2.6 本章小结
• 第三章 ChPBN脂质体的制备
• 3.1 ChPBN脂质体含量测定及包封率测定方法的建立
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 检测方法的建立
• 3.1.4 标准曲线的绘制
• 3.1.5 方法回收率
• 3.2 ChPBN脂质体的分离及包封率的测定
• 3.2.1 PBS缓冲液（pH=7.4）的配置
• 3.2.2 透析时间的确定
• 3.2.3 脂质体与游离ChPBN分离可行性实验
• 3.2.4 包封率测定方法
• 3.3 ChPBN脂质体的制备
• 3.3.1 制备方法的筛选
• 3.3.2 单因素实验
• 3.3.2.1 胆固醇-磷脂质量比对包封率的影响
• 3.3.2.2 药脂比对包封率的影响
• 3.3.2.3 超声时间对包封率的影响
• 3.3.2.4 正交设计法优选最佳处方
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 PBN及其衍生物的细胞生物学研究
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 材料
• 4.2 材料处理
• 4.2.1 RPMI1640培养液的配制
• 4.2.2 DMEM培养液的配制
• 4.2.3 细胞培养
• 4.2.4 MTT溶液的配制
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 MTT法测PBN、MitoPBN、ChPBN及ChPBN脂质体的细胞毒性
• 4.3.2 PBN对HepG2细胞毒性
• 4.3.3 ChPBN及其脂质体对HepG2细胞毒性
• 4.3.4 MitoPBN对HepG2细胞毒性
• 4.3.5 MitoPBN对几种癌细胞毒性
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第五章 ESR表征自旋捕捉性能
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 仪器
• 5.2 检测方法
• 5.3 ESR检测结果
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢