以gbss、ssⅢ和ssⅡ为靶标的RNAi载体构建及转基因马铃薯植株的获得

论文摘要

马铃薯（Solanum tuberosum L）是淀粉生产的重要原料,其淀粉具有优良的特性,广泛应用于工业、食品及化工行业。但在大多数应用领域中,一般要求淀粉具有较低的糊化温度和较弱的凝沉（老化）性,因而淀粉的糊化和凝沉特性成为其应用的重要参考指标,而这两种性质主要与直链淀粉与支链淀粉比例、淀粉链长以及淀粉的结构有关。因此,培育具有较低糊化温度和优良凝沉特性的品种,对于提高马铃薯淀粉的应用范围和促进产业的发展具有重要的意义。随着人们对淀粉生物合成途径相关酶生化代谢途径及分子机理研究的不断深入,使得应用基因工程技术调控淀粉合成过程中相关酶基因的表达,从而使得降低淀粉糊化温度和提高冻融稳定性成为可能。为此,本研究开展了以RNAi技术对马铃薯块茎内源gbss、ssⅢ和ssⅡ基因进行同时干扰,期望通过改变淀粉合成相关酶的活性,进而改变块茎中积累的淀粉分子组成,获得糊化温度低且冻融稳定性更好的加工型马铃薯品种。经过研究,已取得了如下结果:（1）应用blast及分子生物学软件DNAstar对gbss、ssⅡ和ssⅢ基因的cDNA序列同源性进行分析比较,分别从gbss、ssⅢ和ssⅡ基因cDNA片段ORF中筛选出了1～261、2 164～2 407、161～441之间的序列片段作为靶标,采用一步PCR法将靶标基因片段进行融合,得到了大小为785 bp的gbss、ssⅡ和ssⅢ三个基因片段的融合基因。（2）为便于构建RNAi载体,分别以LS-8质粒（含gbss基因5’侧翼序列）、LS-4质粒（含patatin启动子序列）为模板,亚克隆了马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合成酶gbss基因5’侧翼序列及马铃薯patatin启动子,并在这两个启动子5’和3’加入了Sac I和Xho I限制性酶切位点。（3）分别构建了以gbss基因5’侧翼序列和patatin组织特异性启动子驱动的含有“正向gbs3s2融合片段-pdk内含子-反向gbs3s2融合片段”的植物表达载体pART-GF、pART-PF,并将其成功导入根癌农杆菌LBA4404。（4）选用马铃薯“NHD3”、“NF”和“NC”的茎段作为外植体材料,在MS培养基基本成分的基础上,对生长激素的浓度和配比进行了优化,筛选出有利于受体材料高效再生的培养基配方,其中有利于茎段愈伤诱导的培养基为:MS0 + 1.0 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA（NHD3）;MS0 + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA（NC）;MS0 + 1.0 mg/L 6-BA + 0.4 mg/L NAA（NF）。初步建立并优化了遗传转化体系。（5）用携带pART-GF植物表达载体的农杆菌对NHD3、NF和NC三个优良马铃薯品种进行了遗传转化,初步获得了抗性植株,经PCR检测有10株呈阳性,其中在NC、NF和NHD3品种上分别得到的转基因阳性植株为2株、3株和5株。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词表
• Ⅰ 引言
• Ⅱ 文献综述
• 1 马铃薯淀粉的生产和应用现状
• 1.1 马铃薯淀粉生产概况
• 1.2 马铃薯淀粉的应用现状
• 1.2.1 马铃薯天然淀粉的独特优点
• 1.2.2 马铃薯淀粉的应用
• 2 淀粉的生物合成
• 2.1 淀粉的组成与结构
• 2.2 参与淀粉合成的主要酶
• 2.3 淀粉生物合成机制
• 3 淀粉糊化特性及冻融稳定性与淀粉组分的关系
• 4 基因工程在马铃薯品质改良中的应用
• 5 RNA 干扰
• 5.1 RNA 干扰现象的发现
• 5.1.1 RNAi 理论的萌芽
• 5.1.2 RNAi 理论的诞生
• 5.2 RNAi 的作用类型及其机制
• 5.2.1 转录水平基因沉默
• 5.2.2 转录后水平基因沉默
• 5.3 RNAi 技术的特点
• 5.3.1 普遍性
• 5.3.2 高效性
• 5.3.3 特异性
• 5.3.4 可传播性
• 5.3.5 可遗传性
• 5.3.6 扩散性
• 5.3.7 位置效应
• 5.4 RNAi 技术在作物品质改良中的研究进展
• 5.4.1 利用RNAi 调控某一物质含量以提高作物品质
• 5.4.2 利用RNAi 提高果实耐贮性
• 5.4.3 利用RNAi 提高抗褐化能力
• 5.4.4 利用RNAi 进行代谢调控以获得目的次生代谢物
• 5.5 RNAi 技术发展前景
• Ⅲ 本研究的目的和意义
• Ⅳ 研究技术路线
• Ⅴ 试验材料与方法
• 1 材料
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 植物材料
• 1.3 工具酶和试剂
• 1.4 培养基
• 1.4.1 细菌培养基
• 1.4.2 植物组织培养基
• 1.5 琼脂糖凝胶电泳缓冲液
• 2 方法
• 2.1 DNA 的提取制备
• 2.1.1 大肠杆菌质粒DNA 小量碱法提取
• 2.1.2 农杆菌Ti 质粒DNA 碱法小量提取
• 2.1.3 植物叶片DNA 的CTAB 法提取
• 2.2 感受态细胞的制备及转化
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 对大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.3 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.4 根癌农杆菌感受态细胞的转化
• 3 基因克隆
• 3.1 融合基因片段的选择
• 3.2 引物设计
• 3.3 靶标基因片段的扩增及回收
• 3.3.1 各靶标基因片段的扩增
• 3.3.2 目的片段的回收
• 3.4 靶标基因片段的融合及测序
• 3.4.1 靶标基因片段的PCR 融合扩增
• 3.4.2 靶标基因片段重组克隆子的篮白斑筛选及测序
• 3.5 gbss 基因5'侧翼序列、patatin 启动子的亚克隆及其与T 载体连接、测序
• 3.5.1 gbss 基因5'侧翼序列、patatin 启动子的亚克隆
• 3.5.2 gbss 基因5'侧翼序列、patatin 启动子与T 载体连接及测序
• 4 植物表达载体的构建
• 4.1 CaMV 35S 启动子驱动的中间干扰载体的构建
• 4.1.1 正向目的片段F1 与pHANNIBAL 载体的重组
• 4.1.2 反向目的片段F2 与pHF1 载体的重组
• 4.2 gbss 基因5'侧翼序列与patatin 启动子驱动的中间干扰载体构建
• 4.2.1 启动子片段与载体的酶切消化、回收
• 4.2.2 启动子片段与pHF 载体的连接反应
• 4.2.3 重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及其筛选
• 4.2.4 重组质粒PCR 及酶切鉴定
• 4.3 gbss 基因5'侧翼序列与patatin 启动子驱动的融合基因RNAi 表达载体的构建
• 4.3.1 目的片段与载体的酶切消化、回收
• 4.3.2 目的片段与pART27 载体的连接反应
• 4.3.3 重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及其筛选
• 4.3.4 重组质粒的PCR 及酶切鉴定
• 5 gbss 基因5'侧翼序列与patatin 启动子驱动的融合基因RNAI 表达载体转化农杆菌
• 5.1 植物表达载体对农杆菌的转化
• 5.2 工程农杆菌的PCR 鉴定
• 6 根癌农杆菌介导法对马铃薯的遗传转化研究
• 6.1 遗传转化再生体系的建立
• 6.2 农杆工程菌转化马铃薯外植体
• 6.2.1 马铃薯组培苗的复壮
• 6.2.2 农杆菌工程菌菌液的准备
• 6.2.3 外植体的预培养
• 6.2.4 农杆菌转化外植体的方法
• 7 转基因马铃薯植株的获得与PCR 鉴定
• 7.1 转基因马铃薯植株的获得
• 7.2 转基因马铃薯植株的PCR 鉴定
• Ⅵ 结果与分析
• 1 融合基因片段的选择
• 1.1 对三个淀粉合成酶基因cDNA 非同源区段的分析
• 1.2 对三个淀粉合成酶基因cDNA 非同源区段的选择
• 2 引物设计
• 2.1 gbss 基因引物
• 2.2 ssⅢ基因引物
• 2.3 ssⅡ基因引物
• 2.4 gbss 基因5'侧翼序列引物
• 2.5 patatin 启动子引物
• 3 靶标基因片段及启动子的扩增
• 3.1 靶标基因片段的扩增
• 3.2 启动子的亚克隆
• 4 靶标基因片段的融合和测序
• 4.1 PCR 一步法对靶标基因片段的融合结果
• 4.2 靶标基因片段的融合结果
• 4.3 靶标基因片段的PCR 融合扩增产物的酶切检测
• 4.4 融合基因片段测序结果
• 5 gbss 基因5'侧翼序列、patatin 启动子与T 载体连接、测序
• 6 中间干扰载体的构建
• 6.1 CaMV 35S 启动子驱动的中间干扰载体的构建
• 6.2 gbss 基因5'侧翼序列、patatin 启动子驱动的融合基因RNAi 中间载体的构建
• 7 gbss 基因5'侧翼序列和patatin 启动子驱动的融合基因RNAi 载体构建
• 7.1 gbss 基因5'侧翼序列驱动的融合基因RNAi 载体构建
• 7.2 patatin 启动子驱动的融合基因RNAi 载体构建
• 8 农杆菌工程菌的鉴定结果
• 9 根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化结果
• 10 转基因马铃薯植株的PCR 鉴定结果
• Ⅶ 讨论
• 1 融合基因的构建
• 2 ihpRNA 载体的构建
• 3 关于马铃薯块茎淀粉糊化品质的研究
• Ⅷ 结论
• Ⅸ 参考文献
• Ⅹ 附图
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介