论文摘要
猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种急性、热性和高度致死性的传染病,给养猪业造成了巨大的经济损失。在我国,猪瘟的危害仍十分严重,猪瘟的流行呈现出典型猪瘟和非典型猪瘟,持续感染和隐性感染共存的特征,使猪瘟的防控更为困难和复杂。免疫接种仍然是防控猪瘟的主要手段,研究可以鉴别自然感染和疫苗免疫的猪瘟基因工程疫苗是目前猪瘟疫苗研发的重点和热点。猪瘟病毒的E2蛋白是刺激猪体产生保护性中和抗体的主要抗原,也是在基因工程疫苗研究中研究最多的猪瘟病毒的结构蛋白。本研究通过构建表达猪白介素2（ Porcine interleukin 2,pIL-2）的腺病毒表达载体和共表达猪瘟E2基因和pIL-2基因的腺病毒载体,目的在于寻求一种具有良好免疫原性的,可以诱导动物产生针对E2蛋白的保护性抗体的腺病毒载体疫苗和具有免疫增强作用的细胞因子佐剂,为猪瘟的腺病毒活载体疫苗的开发奠定基础。（1）表达pIL-2的腺病毒载体的构建及鉴定。首先用RT-PCR方法分别从经过刀豆蛋白刺激的猪的全血淋巴细胞中扩增出pIL-2基因,经过序列测定,与GenBank中的pIL-2序列的同源性为100%,提交GenBank,获得序列号为FJ543108,然后将pIL-2克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建出重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-pIL-2,用PmeⅠ内切酶对pAdTrack-pIL-2质粒酶切线性化,回收后转化含有腺病毒骨架载体pAdEasier-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中,穿梭载体和骨架载体发生同源重组,经鉴定获得重组腺病毒骨架载体pAdEasy-pIL-2。PacⅠ酶切并回收pAdEasy-pIL-2,用通过脂质体介导法转染HEK293细胞,获得了含有目的基因的重组腺病毒pAdEasy-pIL-2。经PCR和RT-PCR检测证实,重组腺病毒能稳定携带pIL-2基因。经过连续传代扩增,检测到该重组腺病毒的滴度可以达到108. 25 pfu/mL。（2）共表达猪瘟E2基因和pIL-2的腺病毒载体的构建及鉴定。首先用PCR方法分别扩增出pIL-2基因和E2基因,通过中间共用引物将E2基因和pIL-2连接,然后将E2-pIL-2克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建出重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-E2-pIL-2,用PmeⅠ内切酶对pAdTrack-E2-pIL-2质粒酶切线性化,回收后转化含有腺病毒骨架载体pAdEasier-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中,穿梭载体和骨架载体发生同源重组,经鉴定获得重组腺病毒骨架载体pAdEasy-E2-pIL-2。PacⅠ酶切并回收pAdEasy-E2-pIL-2,通过脂质体介导法转染HEK293细胞,获得了含有目的基因的重组腺病毒pAdEasy-E2-pIL-2。经PCR、RT-PCR和Western blot检测证实,重组腺病毒稳定携带E2-pIL-2基因。经过连续传代扩增,检测到该重组腺病毒的滴度可达到108.12 pfu/mL。（3）重组腺病毒对兔的保护性试验。用构建好的重组腺病毒pAd- pIL-2、表达猪瘟病毒石门株E2基因和pIL-2的重组腺病毒pAd-E2-pIL-2皮下接种免疫兔2次（间隔14 d）,免疫剂量均为2×107 pfu。同时设非重组腺病毒接种组和兔化弱毒阳性对照组。二免14d后进行猪兔化弱毒疫苗攻击,通过对兔体体温和抗体的检测,单独免疫pAd-E2-pIL-2和与pAd-pIL-2共同免疫和兔体发热都具有一定的保护能力,为猪瘟活载体疫苗的研发奠定了基础。