极细链格孢菌66kDa激活蛋白的纯化、理化性质和生物活性分析

论文摘要

本文以极细链格孢菌为材料,进行66kDa激活蛋白的提取、分离和纯化,得到银染电泳级的纯品;并对该蛋白进行了生物活性、理化性质、糖蛋白鉴定、质谱分析等研究,为进一步研究该蛋白的作用机理奠定了理论基础。具体结果如下:1极细链格孢菌66kDa激活蛋白的提取、分离和纯化以Good氏缓冲液系统筛选出适合提取及保存极细链格孢菌66kDa激活蛋白的缓冲液,利用鱼精蛋白去除了粗蛋白提取液大部分的核酸物质,利用活性碳吸附有效去除了部分色素。通过乙醇沉淀的方法对粗蛋白进行了初步分级分离,利用DEAE阴离子交换层析进行纯化,HiprepTM Desalting凝胶柱脱盐,超滤浓缩后SDS-PAGE检测得到银染电泳纯的单一蛋白条带。2极细链格孢菌66kDa激活蛋白的理化性质通过SDS-PAGE测得该蛋白的表观分子量为66kDa;利用双向电泳技术测得该蛋白的等电点约为4.27;纯化的目的蛋白经100℃加热处理后冷却至室温进行SDS-PAGE检测表明该蛋白是热稳定蛋白。3极细链格孢菌66kDa激活蛋白的糖染色鉴定以辣根过氧化酶（糖蛋白）为阳性对照,大豆胰蛋白酶为阴性对照,在SDS-PAGE上分别进行蛋白银染的糖蛋白特异性染色,结果显示纯化的66kDa蛋白为糖蛋白。4极细链格孢菌66kDa激活蛋白的生物活性测定分别以4μg/mL、6μg/mL和8μg/mL浓度的蛋白溶液喷雾处理三生烟,72h后摩擦接种TMV（烟草花叶病毒）,72h后测得以8μg/mL蛋白溶液浓度处理的三生烟枯斑抑制率可达到49%。以8μg/mL浓度的蛋白溶液浸种处理小麦种子（品种CA0493）发芽后分别进行室温及15℃低温培养,5天后测定株高,室温培养的处理及对照平均株高分别为9.87和9.82cm,无明显差异;15℃低温培养处理平均株高为6.89cm,对照平均株高为4.7cm,处理后小麦抗逆生长效果显著。5极细链格孢菌66kDa激活蛋白的生物质谱分析纯化的目的蛋白经蛋白酶解后进行质谱分析,得到10多个相关片段信息,经MASCOT比对发现目的蛋白与数据库中的链格孢菌中的蛋白质二硫键异构酶有部分匹配。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 微生物防治研究进展
• 1.1.1 生物农药简介
• 1.1.2 微生物农药概述
• 1.2 蛋白类激发子研究概况
• 1.2.1 过敏蛋白Harpin
• 1.2.2 激发素Elicitins
• 1.2.3 植物激活蛋白 Activator
• 1.3 链格孢菌激活蛋白研究现状
• 1.3.1 链格孢菌分类地位
• 1.3.2 链格孢菌生物资源利用
• 1.4 研究目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验菌种、培养基及相关生测材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要实验仪器与耗材
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的提取、分离和纯化
• 2.2.2 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的理化性质
• 2.2.3 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的糖染色鉴定
• 2.2.4 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的生物活性测定
• 2.2.5 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的生物质谱分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 极细链格孢菌 66kDa 激活蛋白的提取、分离和纯化
• 3.1.1 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白提取缓冲液的筛选
• 3.1.2 蛋白浓度标准曲线
• 3.1.3 粗蛋白溶液中核酸及色素的去除
• 3.1.4 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白初分级分离方法比较
• 3.1.5 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的层析分离
• 3.1.6 纯化后目的蛋白的浓缩及SDS-PAGE 银染检测与粗蛋白的对比
• 3.2 极细链格孢菌66KDA 激活蛋白的理化性质
• 3.2.1 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的等电点及纯化蛋白的纯度
• 3.2.2 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的耐热性
• 3.3 极细链格孢菌66KDA 激活蛋白的糖染色鉴定
• 3.4 极细链格孢菌66KDA 激活蛋白的生物活性测定
• 3.4.1 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白诱导烟草抗TMV 的活性测定
• 3.4.2 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白诱导小麦抗低温的活性测定
• 3.5 极细链格孢菌66KDA 激活蛋白的生物质谱分析
• 第四章 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的提取、分离和纯化
• 4.1.2 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的理化性质
• 4.1.3 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的糖染色鉴定
• 4.1.4 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的生物活性测定
• 4.1.5 极细链格孢菌66kDa 激活蛋白的生物质谱分析
• 4.2 结论
• 4.2.1 66kDa 激活蛋白的纯化方法的建立
• 4.2.2 目的蛋白的纯度、等电点及耐热性
• 4.2.3 目的蛋白鉴定为糖蛋白
• 4.2.4 确定了目的蛋白的生物活性
• 4.2.5 运用质谱技术初步得到了目的蛋白的序列信息
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者简介
• 导师简介