三种核型多角体病毒基因组学分析

论文摘要

茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis oblique nucleopolyhedrovirus，EcobNPV）、茶毛虫核型多角体病毒（Euproctis pseudoconspersa nucleopolyhedrovirus，EupsNPV）和棉铃虫核型多角体病毒（Helicoverpa armigera nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HearNPV）分别是茶尺蠖、茶毛虫和棉铃虫的重要病源性天敌，在我国已被广泛用作对这些害虫的生物防治。但与化学杀虫剂相比，这些杆状病毒的杀虫速度较慢。因此，需要经过基因工程途径进行改造，以提高杀虫效果。对上述病毒的基因组结构进行充分的了解，则是进行这种改造的前提。本论文中，作者分别测定了EcobNPV、EupsNPV和HearNPV C1株基因组全序列并进行了基因组学分析。主要结果如下：1．EcobNPV的形态和生物学特性分析采用虫体纯化的方法，得到了EcobNPV纯化株。透射电镜观察，纯化的EcobNPV包涵体呈不规则形状，直径大小为0.7-1.7uM不等（1.15±0.27uM：mean±SD）。病毒粒子的长约250nm，宽约40nm，每个包涵体内有多个杆状病毒粒子，每个病毒粒子内只有一个核衣壳。在茶尺蠖的2龄幼虫体内对EcobNPV的感染能力进行了评估，确定了病毒的致死浓度和致死时间。随着EcobNPV使用浓度的增加，茶尺蠖幼虫的死亡率升高，病毒致死时间相应缩短。当用高浓度的EcobNPV（介于20，000和2，000PIB/ml之间）来处理2龄幼虫时，所有幼虫在10-14天之间死亡。用0.2PIB/ml的浓度来处理幼虫时，只有30.6％的幼虫在处理后18天内死亡。时间-剂量-死亡率的分析结果表明，感染7天和14天的半致死浓度(LC50)分别为104.09PIB/ml和100.8PIB/ml。当处理浓度为2，000PIB/ml时，其半致死时间LT50是8.5天而LT90则为10.7天。2．EcobNPV基因组全序列分析测定了EcobNPV基因组全序列，绘制了EcobNPV的详细的图谱，对各基因在基因组中的位置、大小进行了标定并与其它杆状病毒基因组进行了比较。EcobNPV基因组全长131，204bp，碱基组成中G+C含量为37.6％。推断EcobNPV基因组含有126个ORF，其大小在150个核苷酸以上，并与其它ORF具有最小的重叠。所有的编码区占整个基因组的89.8％。其中123个ORF与已测序的其它杆状病毒的ORF具有同源性，还有3个为该基因组特有。EcobNPV中有4个基因各含有2个拷贝，包括bro，odv-e66，p26和dbp。每个基因中的两个拷贝是从不同的来源获得的。该基因组中存在3个非编码的同源区（hr），长度为493-1615bp，每个hr由24bp的回文序列和约37bp的重复序列构成。根据基因的同源性和基因对等排列（gene parity plots）情况，EcobNPV与GroupⅡNPV最为接近。3．HearNPV C1株基因组全序列分析测定了HearNPV-C1基因组全序列并与HearNPV-G4进行了比较分析。二者感染相同的宿主并具有相同的地理分布，但对宿主的毒力不同。HearNPV-C1基因组大小为130，759bp，G+C含量为38.9％，含有137个推测的ORF。两种基因组核苷酸序列的相似性为98.1％。与HearNPV-G4相比，HearNPV-C1中共有555bp的替代，1354bp的缺失及710bp的插入。对两种基因组的ORF和同源区（hr）进行比较发现，两种基因组的不同点主要发生在四个高度变化的区域，包括hr1，hr4，hr5和bro-b。所有上述变化均发生在重复区。分析结果表明，杆状病毒的种群或品系之间的差异经常是由单核苷酸多态性（SNPs）及hr和bro基因的变化所造成的。4．EupsNPV基因组全序列分析对EupsNPV的全基因组序列进行了分析，并与其他几种杆状病毒的基因组做了比较。EupsNPV基因组全长为140，620bp，碱基组成中G+C含量为40.4％。该基因组含有139个推测的ORF，其中13个ORF为EupsNPV所特有。编码区和非编码的序列分别为124，275和14，664bp，分别占整个基因组的89.5％和10.5％。在EupsNPV基因组中存在4个hr，不同hr间的重复序列各不相同。该基因组中有3个基因各含有2个拷贝，包括bro，p26和dbp，且每个基因中的两个拷贝来源不同。比较分析表明，EupsNPV与GroupⅡNPV较为类似，其中与EcobNPV的亲缘关系最近，同时该基因组有自己独特的组织特性。5．EupsNPV、EcobNPV和HearNPV-C1基因组比较分析对EupsNPV、EcobNPV和HearNPV-C1的基因组结构及进化关系进行了比较分析。三种病毒的基因组大小接近，G+C含量相似。三个基因组共有的ORF为102个，其中包括30个杆状病毒核心基因。EupsNPV与EcobNPV之间氨基酸的平均同源性为46％，高于EupsNPV和HearNPV-C1之间氨基酸的平均同源性（38％）。它们均不含有GroupⅠNPV所特有的gp64囊膜蛋白基因。在EupsNPV与EcobNPV的比较中，无论是EupsNPV还是EcobNPV的特有ORF数目都少于其与HearNPV-C1比较时各自特有的ORF数。三种基因组同源区（hr）的重复序列完全不同，且回文序列只存在于EcobNPV中，而EupsNPV和HearNPV-C1仅含有重复序列。三种病毒在基因内容、同源基因的相似程度及在基因组中的排列顺序、分子进化树方面的比较表明，EupsNPV与EcobNPV的共同祖先比EupsNPV与HearNPV C1的共同祖先在进化上更为接近。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 文献综述:杆状病毒基因组学研究进展
• 1.1 杆状病毒基因组结构
• 1.2 杆状病毒核心基因
• 1.3 杆状病毒的重复基因
• 1.4 杆状病毒基因组进化
• 第二章 茶尺蠖核型多角体病毒的形态和生物学特性研究
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果和讨论
• 第三章 茶尺蠖核型多角体病毒基因组全序列分析
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果和讨论
• 3.3 结论
• 第四章 棉铃虫核型多角体病毒HearNPVC1株全序列基因组学分析及与G4株的比较
• 4.1 材料和方法
• 4.2 结果和讨论
• 4.3 结论
• 第五章 茶毛虫核型多角体病毒基因组全序列分析
• 5.1 材料和方法
• 5.2 么结果和讨论
• 5.3 结论
• 第六章 三种核型多角体病毒基因组比较
• 6.1 材料和方法
• 6.2 结果和讨论
• 6.3 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 在学期间发表和接受的论文
• 致谢