用AFLP标记对甘肃地方核桃种质资源遗传多样性分析

论文摘要

我国是核桃的起源地之一,甘肃为我国核桃原产地域之一,种质资源十分丰富,存在许多特异种质资源。但由于长期实生繁殖,品种命名标准不一,造成品种资源底码不清,同名异物或同物异名现象严重,给核桃资源研究、保存、评价、利用及新种质的创新等带来很大困难。尽管前人利用分子标记对核桃也进行了一些研究,但利用AFLP技术对核桃进行研究的报道寥寥无几。本研究建立了较稳定的核桃AFLP反应体系,构建了69份核桃材料的指纹图谱,分析了其遗传多样性,以期为核桃品种鉴定、亲缘关系分析、高密度遗传图谱构建、核心种质构建等奠定基础。主要研究结果如下:1.从8种植物基因组DNA提取方法中筛选出适合核桃AFLP分析的DNA提取方法——改良CTAB法Ⅲ。采用该方法进行核桃叶片DNA的提取,方便快捷,并且能提出完全适合AFLP标记技术所需的高质量DNA。2.通过对核桃AFLP反应体系进行系统研究,建立了适于核桃AFLP分析的最佳体系。在20μL酶切体系中,包括纯化后的基因组DNA500ng,EcoRI（NEB公司） 6U,MseI（NEB公司） 3U,37℃水浴酶切5h;酶切后,加入5uL连接混合液,其中包括:MseI adapter（50pmol.uL-1） 1.0μL,EcoRI adapter（5pmol.μL-1） 1.0μL,ATP （10mmol.μL-1） 1.6μL,T4DNAligase（10U.μL-1） 0.13μL,T4Buffer 0.5μL,在恒温槽中16℃保温10h以上或过夜;连接完成后,将连接产物置于设定在65℃下PCR内变性10min,以去除连接酶的活性。之后,连接产物稀释20倍进行预扩增;预扩产物稀释20倍进行选择性扩增;20μL预扩增和选择性扩增体系中包括:稀释后模板DNA 5μL,TaqDNApolymerase（5U.μL-1） 0.3μL,MgCl2（25mM） 1.2μL,MseI primer（50ng.uL-1） 1.2μL,EcoRI primer（50ng.μL-1） 1.2U。选择扩增产物加入10μL LoadingBuffer,95℃变性10min后,在6%变性聚丙烯酞胺凝胶上进行电泳分析;银染法检测PCR产物。3.从81对引物组合中选出8对谱带较清晰、多态性较高的引物组合,对69份供试样品进行扩增分析,共扩增出438条电泳谱带,其中399条为多态性带,多态性比率为91.10%。4.使用NTSYSpc-2.10e软件,利用UPGMA法对供试材料进行聚类,建立了69份甘肃地方核桃资源的AFLP聚类图。对其遗传多样性进行了分析,揭示了甘肃地方核桃资源间遗传背景的相似性及复杂性。进一步证明了甘肃为我国核桃原产地域之一。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 遗传多样性
• 2 遗传标记的研究进展
• 2.1 遗传标记概述
• 2.2 常规鉴定技术
• 2.3 DNA 分子标记技术
• 3 AFLP 标记技术的研究进展
• 3.1 AFLP 技术的基本原理
• 3.2 AFLP 技术流程
• 3.3 AFLP 的技术特点
• 4 AFLP 技术在果树中的应用
• 5 核桃种质资源的研究现状
• 第二章 研究思路、内容及方法
• 1 试验目的及研究思路
• 1.1 研究目的
• 1.2 研究思路
• 2 实验材料
• 2.1 供试材料的采集和整理
• 2.2 引物和接头
• 3 试剂和仪器设备
• 3.1 主要试剂
• 3.2 试剂的配制
• 3.3 主要仪器设备
• 4 实验方法
• 4.1 模板 DNA 的制备
• 4.2 核桃基因组 DNA 的检测
• 5 AFLP 反应体系的建立与优化
• 5.1 酶切体系
• 5.2 连接
• 5.3 预扩增
• 5.4 选择性扩增
• 6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 7 银染显色
• 8 数据统计与分析
• 第三章 结果与分析
• 1 模板DNA 的制备
• 1.1 适于核桃基因组提取方法的研究
• 1.2 核桃基因组DNA 的提取
• 2 核桃AFLP 反应体系的建立
• 2.1 酶切体系的优化
• 2.2 连接体系的优化
• 2.3 PCR 扩增反应体系的优化
• 3 引物筛选
• 4 供试核桃材料的AFLP 分析
• 4.1 多态性分析
• 4.2 聚类分析
• 第四章 讨论
• 1 核桃AFLP 反应体系的技术要点
• 1.1 核桃基因组DNA 的提取
• 1.2 核桃基因组 DNA 的AFLP 反应体系
• 1.3 电泳和银染检测
• 2 核桃的指纹图谱
• 3 核桃的遗传多样性
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 导师简介