论文摘要
铁作为人体必需的微量元素,广泛参与体内的代谢过程。铁缺乏和铁过量对机体都将产生不良影响。肝脏是机体主要的铁贮存部位,同时在铁稳态的调节中起着中心和枢纽作用,铁调素等许多重要的铁代谢相关蛋白都是肝脏特异性合成分泌的。细胞铁稳态主要通过IRE/IRP系统调节,机体铁稳态主要通过一种阻止铁进入血液的激素hepcidin调控。相关临床资料和流行病学调查中发现,发现糖尿病组的血清铁水平比对照组高,糖尿病随病情发展常伴有铁蓄积加重。体外实验显示,用20mmol/L浓度葡萄糖处理小鼠胰岛组织,其H-铁蛋白mRNA比lmmol/L浓度的要高出4-8倍。在链脲霉素诱导的糖尿病大鼠肾脏中,TfR表达增加。另有实验表明,高糖可以刺激细胞产生过量ROS。过多的ROS除了直接发挥细胞毒性作用外,还能够通过细胞信号传导系统调控铁代谢相关蛋白表达。越来越多的证据揭示,铁代谢和糖代谢之间存在相互影响,二者的关系可能是双向的,即铁代谢异常可以影响糖代谢；而长期高血糖又可损伤铁代谢通路。但确切的机制尚未完全阐明。目的利用体外培养正常人肝细胞LO2,设定不同葡萄糖浓度培养环境,观察不同浓度葡萄糖对细胞铁代谢调控相关蛋白表达的影响,为探讨糖代谢与铁代谢的关系提供实验依据。方法一、不同糖浓度培养对LO2细胞ROS、MDA水平和铁代谢相关蛋白表达的影响细胞分组：LO2细胞（购自中科院上海细胞库）,分为5.5mmol/L组,15mmol/L组和25mmol/L组。培养基为DMEM,加2%新生牛血清和青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml,葡萄糖浓度分别为5.5mmol/L,15mmol/L和25 mmol/L,培养时间分别为0h,12h,24h和48h。指标测定：用荧光染色法检测细胞ROS水平；用TBA法检测细胞MDA水平；用蛋白免疫印迹法检测铁调节蛋白1（IRP1）、转铁蛋白受体1（TfR1）、转铁蛋白受体2（TfR2）、铁调素（hepcidin）蛋白表达量。二、过氧化氢对LO2细胞ROS、MDA水平和铁代谢相关蛋白表达的影响细胞分组：LO2细胞用终浓度为100μmol/L过氧化氢处理,对照组只加入等量的培养基。培养基为DMEM,加2%新生牛血清和青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml,葡萄糖浓度为5.5mmol/L。培养时间为60min。指标测定：用荧光染色法检测细胞ROS水平；用TBA法检测细胞MDA水平；用蛋白免疫印迹法检测铁调节蛋白1（IRP1）、转铁蛋白受体1（TfR1）、转铁蛋白受体2（TfR2）、铁调素（hepcidin）蛋白表达量。三、Vit.E对不同糖浓度培养LO2细胞ROS、MDA水平和铁代谢相关蛋白表达的影响细胞分组：LO2细胞分为5.5mmol/L组,15mmol/L组和25 mmol/L葡萄糖组培养,各浓度葡萄糖组又分为0.1mg/L、1mg/L和10mg/L的Vit.E处理组,各浓度葡萄糖对照组只加入等量相应葡萄糖浓度培养基。培养基为DMEM,加2%新生牛血清和青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml,葡萄糖浓度分别为5.5mmol/L,15mmol/L和25mmol/L,培养时间为24h。指标测定：用荧光染色法检测细胞ROS水平；用TBA法检测细胞MDA水平；用蛋白免疫印迹法检测铁调节蛋白1（IRP1）、转铁蛋白受体1（TfR1）、转铁蛋白受体2（TfR2）、铁调素（hepcidin）蛋白表达量。各组实验的图象分析及数据统计：采用Quantity One图像分析系统进行分析,实验数据用（（?）±S）表示,数据统计处理应用统计软件SPSS 13.0,统计方法采用方差分析。结果一、不同糖浓度培养对LO2细胞ROS、MDA水平和铁代谢相关蛋白表达的影响（一）荧光显微镜下观察细胞荧光染色1、在体外培养12h、24h、48h时间点,各组细胞荧光强度均随葡萄糖浓度升高而增强。2、各浓度葡萄糖组细胞的荧光强度均随细胞培养时间延长逐渐增强,其中15mmol/L和25mmol/L葡萄糖组随细胞培养时间延长其荧光强度增强幅度比5mmol/L组更明显。（二）不同糖浓度培养对LO2细胞ROS和MDA水平的影响1、与5.5mmol/L组相比：体外培养12h时,15mmol/L组ROS和MDA水平分别升高了44.8%和96.5%,25mmol/L组ROS和MDA水平分别升高了76.3%和227.8%（P<0.01）；体外培养24h时,15mmol/L组ROS和MDA水平分别升高了56.8%和145.3%,25mmol/L组ROS和MDA水平分别升高了89.5%和242.2%（P<0.01）；体外培养48h时,15mmol/L组ROS和MDA水平分别升高了73.5%和159.5%,25mmol/L组ROS和MDA水平分别升高了92.9%和208.7%（P<0.01）。2、与Oh相比：5.5mmol/L葡萄糖组细胞ROS和MDA水平在体外培养24h分别升高了26.3%和17.3%,在体外培养48h分别升高了37.5%和34.4%（P<0.05）；15mmol/L葡萄糖组细胞ROS和MDA水平在体外培养12h分别升高了72.6%和98.4%,在体外培养24h分别升高了111.8%和177.3%,在体外培养48h分别升高了155.2%和236%（P<0.001）；25mmol/L葡萄糖组细胞ROS和MDA水平在体外培养12h升高了101.5%和262.1%,在体外培养24h分别升高了145.3%和310.6%,在体外培养48h升高了171.9%和324.3%（P<0.001）（三）不同糖浓度对LO2细胞铁代谢相关蛋白表达的影响1.不同糖浓度对LO2细胞IRP1表达的影响（1）与5.5mmol/L相比：体外培养12h时,15mmol/L和：25mmol/L组细胞IRP1表达分别升高了23.5%和40.7%（P<0.01）；体外培养24h时,15mmol/L和25mmol/L组细胞IRP1表达分别升高了85%和116.8%（P<0.001）；体外培养48h时,15mmol/L和：25mmol/L组细胞IRP1表达分别升高了118.4%和166.9%（P<0.001）。（2）与Oh相比：5.5mmol/L葡萄糖组各时间点IRP1表达没有显著性差异（P>0.05）；15mmol/L组IRP1表达在体外培养12h,24h,48h时分别升高了37.9%,77%,109%（P<0.001）：25mmol/L组IRP1表达在体外培养12h,24h,48h时分别升高了45.3%,91.9%,136.3%（P<0.001）。2.不同糖浓度对LO2细胞TfR1表达的影响（1）与5.5mmol/L比：体外培养12h时,15mmol/L和25mmol/L细胞TfR1表达分别升高了23.8%和45.9%（P<0.01）；体外培养24h时,15mmol/L和25mmol/L组细胞TfR1表达分别升高了52.2%和78.5%（P<0.001）；体外培养48h时,15mmol/L和25mmol/L组细胞TfR1表达分别升高了100.1%和111.2%（P<0.001）,而25mmol/L组与15mmol/L组相比TfR1表达没有显著性差异（P>0.05）。（2）与Oh相比：5.5mmol/L葡萄糖组各时间点TfR1表达没有显著性差异（P>0.05）：15mmol/L组TfR1表达在体外培养12h,24h,48h时分别升高了31.6%,56.4%,100.4%（P<0.001）；25mmol/L组TfR1表达在体外培养12h,24h,48h时分别升高了51%,78.6%,106%（P<0.001）。3.不同糖浓度对LO2细胞TfR2表达的影响（1）与5.5mmol/L比：体外培养12h时,15mmol/L和25mmol/L细胞TfR2表达分别升高了90.4%和123.1%（P<0.001）；体外培养24h时,15mmol/L组和25mmol/L组TfR2表达分别升高了141.2%和159.2%（P<0.001）；而25mmol/L组与15mmol/L组相比TfR2表达没有显著性差异（P>0.05）；体外培养48h时,15mmol/L组和25mmol/L组TfR2表达分别升高了190.6%和207.5%（P<0.001）,而25mmol/L组与15mmol/L组相比TfR2表达没有显著性差异（P>0.05）。（2）与Oh相比：各时间点5.5mmol/L葡萄糖组TfR2表达没有显著性差异（P>0.05）；15mmol/L组TfR2表达在体外培养12h,24h,48h时分别升高了88.4%,133.6%,183%（P<0.001）：25mmol/L组TfR2表达在体外培养12h,24h,48h时分别升高了111.5%,140.5%,187%（P<0.001）。4.不同糖浓度对LO2细胞hepcidin表达的影响（1）与5.5mmol/L组相比：体外培养12h时,各浓度葡萄糖组hepcidin表达没有显著性差异（P>0.05）；体外培养24h时,15mmol/L组和：25mmol/L组hepcidin表达分别升高了85.9%和84%（P<0.001）,25mmol/L组与15mmol/L组相比hepcidin表达没有显著性差异（P>0.05）；体外培养48h时,15mmol/L组禾25mmol/L组hepcidin表达分别升高了126.1%和136.3%（P<0.001）,25mmol/L组与15mmol/L组相比hepcidin表达没有显著性差异（P>0.05）。（2）与Oh相比：5.5mmol/L葡萄糖组各时间点hepcidin表达没有显著性差异（P>0.05）；15mmol/L组hepcidin表达分别在体外培养24h,48h时升高了105.4%和134%（P<0.001）；25mmol/L组hepcidin表达分别在体外培养24h,48h时升高了91.5%和130.4%（P<0.001）。二、过氧化氢对LO2细胞ROS、MDA水平和铁代谢相关蛋白表达的影响（一）荧光显微镜下观察细胞荧光染色与对照组相比,过氧化氢组细胞荧光强度显著增强。（）过氧化氢对L02细胞ROS和MDA水平的影响与对照组相比,过氧化氢组细胞ROS和MDA水平分别升高了132.9%和233.3%（P<0.001）（三）过氧化氢对LO2细胞铁代谢相关蛋白表达的影响与对照组相比,过氧化氢组细胞IRP1、TfR1、TfR2分别升高95.4%、61.4%和144.7%（P<0.001）,而hepcidin表达有下降趋势（P>0.05）。三、Vit.E对不同糖浓度培养LO2细胞对LO2细胞ROS、MDA水平和铁代谢相关蛋白表达的影响（一）荧光显微镜下观察细胞荧光染色5.5mmol/L组中,添加各剂量Vit.E后荧光强度变化没有明显差别。而15mmol/L和25mmol/L组中,1mg/L Vit.E组与对照组及其他剂量组相比较,荧光强度明显减弱。（二）Vit.E对不同糖浓度培养LO2细胞ROS和MDA水平的影响（1）与相应葡萄糖浓度对照组相比：5.5mmol/L组添加各剂量Vit.E后细胞ROS、MDA水平没有显著性差异（P>0.05）；15mmol/L组中1 mg/L Vit.E和10mg/L Vit.E组与对照组相比,ROS水平分别降低17.5%和7.4%（P<0.01）,MDA水平分别降低44.2%和29%（P<0.01）：25mmol/L组中1 mg/L Vit.E和10mg/L Vit.E组与对照组相比,ROS水平分别降低20.6%和16%（P<0.01）,MDA水平分别降低49%和34.5%（P<0.01）。15mmol/L和25mmol/L组中,0.1mg/L Vit.E组与对照组相比ROS和MDA水平没有显著性差异（P>0.05）。（2）各剂量Vit.E组内及对照组内：LO2细胞ROS和MDA水平分别随葡萄糖浓度的升高而逐渐升高（P<0.01）。（三）Vit.E对不同糖浓度培养LO2细胞IRP1, TfR1, TfR2表达的影响（1）与相应葡萄糖浓度对照组相比：5.5mmol/L组：各Vit.E剂量组IRP1, TfR1, TfR2表达均无显著性差异（P>0.05）。15mmol/L组：1 mg/L Vit.E和：10mg/L Vit.E组IRP1表达分别降低33.2%和23.2%,TfR1表达分别降低18.5%和13.8%,TfR2表达分别降低22.9%和21.9%（P<0.01）；25 mmol/L组：1 mg/L Vit.E和：10mg/L Vit.E组IRP1表达分别降低21.9%和14.3%,TfR1表达分别降低22.9%和17.7%,TfR2表达分别降低14.2%和11.1%（P<0.01）。15mmol/L和25mmol/L组中,0.1mg/L Vit.E组TfR1、TfR2表达均无显著性差异（P>0.05）。在15mmol/L和25mmol/L组中,添加1mg/L Vit.E和10mg/L Vit.E, TfR1、TfR2表达无显著性差异（P>0.05）。（2）各剂量Vit.E组内及对照组内：LO2细胞IRP1,TfR1, TfR2表达量分别随葡萄糖浓度的升高而逐渐升高（P<0.01）。（四）Vit.E对不同糖浓度培养LO2细胞hepcidin表达的影响与各自相应葡萄糖浓度的对照组相比,添加各种剂量Vit.E后各葡萄糖浓度组内细胞的hepcidin表达没有显著性差异（P>0.05）。但不同葡萄糖浓度组之间hepcidin表达有所差异,15mmol/L和25mmol/L组与5.5mmol/L组相比,hepcidin表达显者升高（P<0.01）,而15mmol/L和25mmol/L组之间hepcidin表达没有显著差异（P>0.05）。结论本研究设定5mmol/L、15mmol/L和25mmol/L三个葡萄糖浓度培养环境,观察在不同浓度葡萄糖条件下体外培养的正常人肝细胞LO2铁代谢调控相关蛋白表达变化。结果发现：1.LO2细胞ROS和MDA水平随培养基中葡萄糖浓度的升高和培养时间延长而升高。2.LO2细胞IRP1、TfR1、TfR2随培养基中葡萄糖浓度的升高而升高。3.在细胞培养基中添加过氧化氢可直接诱导LO2细胞IRP1、TfR1、TfR2表达显著升高。4. Vit.E能够降低高糖培养细胞活性氧的含量,缓解IRP1、TfR1、TfR2蛋白表达增加的幅度。5. hepcidin在高糖培养下表达升高,而在过氧化氢处理下表达有下降趋势。Vit.E处理后hepcidin表达并没有受活性氧水平降低而降低。综合上述研究结果,提示,高浓度葡萄糖可以诱导细胞生成过量ROS,而后者可能是导致高糖环境中细胞IRP1、TfR1、TfR2表达升高的一个重要原因。hepcidin在高糖环境下的表达增加可能不是或不仅仅是受过量ROS的影响,是否还存在其他调控因素则有待进一步研究。
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