葡萄再生体系的建立及葡激酶基因（sak）植物表达载体的构建

论文摘要

本实验以摩尔多瓦（Moldova）、巨峰（Kyoho）和巨玫瑰（Jumeigui）葡萄（VitisVinifera L.）的幼胚、卷须和叶片为外植体,用组织培养的方法建立了葡萄体细胞胚胎发生途径的植株再生体系,并且构建了含有葡激酶基因（sak）的植物表达载体pBISAK和pBIPMI-SAK,对葡萄遗传转化进行了初步研究,为用葡萄体胚作为受体材料进行遗传转化生产葡激酶奠定了基础。论文主要分为两个部分:一、以葡萄品种摩尔多瓦、巨峰和巨玫瑰为材料,通过控制外植体来源、激素水平、冷处理时间等,对体细胞胚胎发生和植株再生进行了研究,主要研究结果如下:1、来自不同品种的幼胚诱导愈伤组织能力不同,其中巨峰诱导率高于巨玫瑰和摩尔多瓦。2、对摩尔多瓦种子进行冷处理能明显提高幼胚产生愈伤组织的能力,当冷处理为10天时,其值达到92.7%,远远高于不经冷处理时的37.9%。3、幼胚是诱导体胚比较合适的外植体,在相同条件下,只有幼胚能产生胚性愈伤组织,而卷须和叶片仅产生非胚性愈伤组织。4、不同浓度NAA和6-BA组合实验结果发现,激素浓度不同,愈伤组织的形态和生长速度有一定的差异,NN+0.5mg/L 6-BA+2 mg/L NAA是比较合适的摩尔多瓦胚性愈伤组织增殖培养基。5、无激素的MS1/2培养基是比较合适的体胚分化培养基。组织化学研究表明体胚经历了与合子胚相似的发育阶段,即球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚,在发育过程中淀粉和蛋白质含量呈动态变化。6、6-BA能明显提高植株再生率,当6-BA浓度为1mg/L时,植株再生率达到43.3%。7、葡萄体胚对卡那霉素比较敏感,含30g/L甘露糖的MS1/2培养基可用作葡萄遗传转化的筛选培养基。二、利用分子克隆技术成功地构建了含甘露糖筛选标记基因（pmi）和葡激酶基因（sak）植物表达载体,并将其转入到根癌农杆菌菌株GV3101中,转化葡萄胚性愈伤组织,获得了GUS检测为阳性的体胚。为下一步进行葡萄遗传转化,获得能表达葡激酶的安全转基因植株奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词（Abbreviation）
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 葡萄基因工程研究进展
• 1.1.1 葡萄基因转化受体系统的建立
• 1.1.2 葡萄遗传转化途径
• 1.1.3 问题和展望
• 1.2 磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）在植物转化中的应用
• 1.3 葡激酶（SAK）的结构特征、生物活性及临床应用前景
• 1.3.1 葡激酶（SAK）的基因及其蛋白质结构
• 1.3.2 葡激酶的作用机理
• 1.3.3 临床应用前景
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 葡萄体细胞胚胎发生及植株再生体系的建立
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 材料的消毒
• 2.2.2 愈伤组织的诱导
• 2.2.3 胚性愈伤组织产生和体胚的诱导
• 2.2.4 体胚的植株再生
• 2.2.5 植株驯化与移栽
• 2.2.6 组织化学分析
• 2.2.7 数据统计
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 愈伤组织的诱导
• 2.3.2 胚性愈伤组织产生与体胚分化
• 2.3.3 植株再生
• 2.3.4 体胚发生过程的组织细胞学观察
• 2.4 讨论
• 2.4.1 外植体、品种对体胚发生的影响
• 2.4.2 激素对体胚发生的影响
• 2.4.3 低温对体胚发生的影响
• 2.4.4 体胚发生能力的长期保持
• 2.4.5 葡萄体胚萌发与植株再生
• 2.4.6 体胚分化发育过程中淀粉蛋白质动态变化
• 3 sak植物表达载体的构建及其对葡萄胚性愈伤组织的遗传转化初步研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 酶和生化试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 目的基因PCR扩增及回收
• 3.2.2 目的基因扩增产物的克隆及测序
• 3.2.3 葡激酶基因植物表达载体的构建
• 3.2.4 植物表达载体转化农杆菌GV3101
• 3.2.5 选择压力实验
• 3.2.6 葡萄的遗传转化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 植物表达载体pBPMI-SAK的构建与鉴定
• 3.3.2 选择压力实验
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 附图
• 作者简介
• 导师简介
• 致谢