hIFNβ-HSA在毕赤酵母中的诱导表达及其降解蛋白酶的鉴定

论文摘要

毕赤酵母是近十年来发展起来的一种真核表达体系,具有表达量高、培养成本低、产物可以分泌到胞外、糖基化程度适中等优点。目前,国内外已有500多种外源蛋白在毕赤酵母中得到表达。但是外源蛋白的降解是毕赤酵母表达体系应用过程中的共性问题,严重影响外源蛋白的积累。本研究室成功构建了IFNβ与人血清白蛋白融合蛋白（Human IFNβ-HSA fusion protein, hIFNβ-HSA）基因并在毕赤酵母（Pichia pastoris KM71）中表达,经检测融合蛋白分子量约为90 kDa,具有HSA的抗原性,用细胞病变抑制法测定摇瓶发酵液上清中融合蛋白的干扰素活性约为640 IU/mL,并通过对5 L发酵罐发酵过程参数及其过程控制对基因工程菌毕赤酵母表达hIFNβ-HSA影响的研究确定一系列的发酵参数。本论文是在此工作基础上,选取的主要结果如下:1.通过单因子实验,确定了最佳的与蛋白酶活性相关的营养和环境条件:pH在5.0-6.0,蛋白胨的最佳添加量为6%。Glu、Ala和Arg三种氨基酸的添加会促进融合蛋白的表达。其最佳作用浓度为0.1%。最后确定了EDTA为促进融合蛋白表达的最适蛋白酶抑制剂,其最佳作用浓度为10 mmol/L。根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理,采用三因素三水平的响应面分析方法,考察了pH、Glu浓度和EDTA浓度对融合蛋白表达的影响,结果表明当pH 5.5、添加Glu浓度为0.18%、EDTA浓度为12 mmol/L时,融合蛋白的表达量最高,为24.87 mg/L,相对于对照组提高了61%。2.通过SDS-PAGE确定融合蛋白hIFNβ-HSA在诱导表达过程中确实发生了降解,降解的主要条带出现在65 kDa;通过Western-Blotting杂交实验,证实了65 kDa的蛋白条带与90 kDa的目的条带在杂交实验中具有相同的蛋白免疫原性,从而确定这条蛋白带为90 kDa目的条带的降解带。通过HPLC证实发酵液中蛋白酶对融合蛋白的降解主要发生在HSA区域。以明胶为底物的SDS-PAGE活性电泳结果表明,诱导表达阶段的发酵上清液和细胞内存在几种蛋白酶。以HSA为底物的SDS-PAGE活性电泳,确定了在发酵液中确实存在一种蛋白酶对融合蛋白进行水解作用。在此基础上,对与标准蛋白分子量Mark进行比较,确定该蛋白酶为蛋白酶B。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 毕赤酵母基因表达系统
• 1.1.1 毕赤酵母的生物学特性
• 1.1.2 毕赤酵母表达宿主菌
• 1.1.3 毕赤酵母表达载体
• 1.1.4 外源蛋白在毕赤酵母中的表达
• 1.2 长效药物研究进展
• 1.2.1 长效药物研究背景
• 1.2.2 常用长效药物研究技术
• 1.3 影响外源蛋白表达的因素
• 1.3.1 稀有密码子
• 1.3.2 外源基因的内在特性
• 1.3.3 基因的拷贝数
• 1.3.4 培养条件
• 1.3.5 蛋白酶的降解
• 1.4 本课题来源和研究内容
• 第二章 营养及环境条件对融合蛋白hIFNβ-HSA 表达的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 主要仪器和设备
• 2.2.5 常用缓冲液的配制
• 2.2.6 培养方法
• 2.2.7 hIFNβ-HSA 的测定
• 2.2.8 表达过程中的单因素影响
• 2.2.9 采用响应面分析方法优化表达的实验设计
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 pH 值对hIFNβ-HSA 表达的影响
• 2.3.2 有机氮源的添加对hIFNβ-HSA 表达的影响
• 2.3.3 不同氨基酸的添加对hIFNβ-HSA 表达的影响
• 2.3.4 Glu、Ala、Arg 的添加对hIFNβ-HSA 表达的影响
• 2.3.5 蛋白酶抑制剂的选择
• 2.3.6 最佳提高融合蛋白表达量的模型验证
• 2.4 本章主要结论
• 第三章 降解hIFNβ-HSA 的毕赤酵母蛋白酶的鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要仪器和设备
• 3.2.5 常用试剂的配制
• 3.2.6 培养方法
• 3.2.7 hIFNβ-HSA 的SDS-PAGE 检测
• 3.2.8 hIFNβ-HSA 的Western-Blotting 鉴定
• 3.2.9 超声波破碎
• 3.2.10 高效液相色谱法（HPLC）检测
• 3.2.11 SDS-PAGE 凝胶活性电泳的测定
• 3.2.12 蛋白酶分子量确定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 融合蛋白诱导表达过程中降解现象的确定
• 3.3.2 HPLC 对融合蛋白降解部位的鉴定
• 3.3.3 毕赤酵母蛋白酶的活性酶谱分析
• 3.3.4 蛋白酶的确定
• 3.4 本章主要结论
• 第四章 结论与展望
• 4.1 主要结论
• 4.2 存在的问题和展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文