喹诺酮类兽药多残留酶联免疫检测方法的建立

论文摘要

本论文对动物性食品中喹诺酮类药物多残留的直接竞争酶联免疫检测方法进行了系统的研究。选择了4种喹诺酮类药物诺氟沙星（Norfloxacin, NOR）、环丙沙星（Cipfloxaxin,CIP）、沙拉沙星（Sarafloxacin, SAR）、氧氟沙星（Ofloxacin, OFL）用活化酯法与BSA偶联制备人工免疫原,通过免疫纯化获得广谱的抗喹诺酮药物多克隆抗体OFL-B和NOR-B,优化了抗体包被量、酶标抗原量、封闭液、封闭时间和竞争时间,建立了OFL-B和NOR-B抗体的直接竞争酶联免疫检测方法,OFL-B抗体可以同时检测氧氟沙星、麻保沙星、氟罗沙星3种喹诺酮类药物的残留,NOR-B抗体可以同时检测16种喹诺酮类药物的残留,对所建立的方法的各种性能指标进行了系统评价,考察了定量限、方法检测限、准确度、精密度。OFL-B抗体所建立的直接竞争酶联免疫法的灵敏度为0.20ng/mL,检测限为0.02ng/mL,以牛奶为例,研究了牛奶基质影响的消除方法,1mL牛奶加入2mL7.5%三氯乙酸,离心,用PBS稀释70倍即可有效消除基质影响,测定了200、100、50、20、10ng/mL五个浓度的添加回收率,回收率在78-113%之间,可用来同时检测氧氟沙星、麻保沙星、氟罗沙星三种喹诺酮类药物；通过高效液相色谱法,对建立的氧氟沙星的直接竞争酶联免疫法的准确性进行了验证,两种方法的检测结果一致性很高,说明所建立的直接竞争酶联免疫法准确可靠。同时,NOR-B抗体所建立的直接竞争酶联免疫法的灵敏度为0.73ng/mL,检测限为0.04ng/mL,牛奶经三氯乙酸处理以后稀释20倍消除基质影响,测定了200、100、50ng/mL三个浓度的添加回收率,回收率在69.3-107.3%之间,可同时检测十六种喹诺酮类药物的残留。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 食品安全现状
• 1.2 兽药残留概述
• 1.2.1 动物性食品中兽药残留的原因
• 1.2.2 动物性食品中兽药残留的危害
• 1.2.3 动物性食品中兽药残留的监控
• 1.3 动物性食品中喹诺酮类药物残留
• 1.3.1 喹诺酮类药物概述
• 1.3.2 喹诺酮类药理化性质
• 1.3.3 喹诺酮类药物代谢动力学
• 1.3.4 喹诺酮类药物残留的危害
• 1.4 喹诺酮类药物残留检测研究进展
• 1.4.1 高效液相色谱法
• 1.4.2 液-质联用法
• 1.4.3 高效毛细管电泳分析法
• 1.4.4 化学发光分析法
• 1.4.5 微生物检测法
• 1.4.6 免疫检测法
• 1.5 免疫学检测方法的研究
• 1.5.1 放射免疫分析法
• 1.5.2 荧光免疫分析法
• 1.5.3 酶免疫分析法
• 1.5.4 免疫金标记技术
• 1.5.5 发光免疫分析法
• 1.6 论文研究的目的及意义
• 1.7 论文研究主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要药品和试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 待测样品
• 2.1.4 常用溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 人工免疫原的制备
• 2.2.2 包被原的制备
• 2.2.3 抗体的制备
• 2.2.4 酶标抗原的制备
• 2.2.5 间接竞争酶联免疫方法的建立
• 2.2.6 直接竞争酶联免疫方法的建立
• 2.2.7 样品基质影响的消除
• 2.3 直接竞争ELISA检测方法性能指标的评价
• 2.3.1 直接竞争ELISA检测方法的检测限与灵敏度
• 2.3.2 直接竞争ELISA检测方法的准确度
• 2.3.3 直接竞争ELISA检测方法的精密度
• 2.3.4 直接竞争ELISA检测方法的特异性
• 2.4 仪器分析法确证
• 2.4.1 高效液相色谱方法标准曲线的建立
• 2.4.2 食品中喹诺酮残留的高效液相色谱分析方法
• 2.4.3 高效液相法与酶联免疫法结果的相关性
• 3 结果与讨论
• 3.1 喹诺酮类药物人工抗原的设计与鉴定
• 3.2 喹诺酮类药物抗体的制备
• 3.2.1 抗血清效价和特异性的测定
• 3.2.2 抗血清纯化及抗体浓度
• 3.3 氧氟沙星、麻保沙星、氟罗沙星多残留ELISA检测方法的研究
• 3.3.1 OFL-B抗体间接竞争酶联免疫法的建立
• 3.3.2 OFL-B抗体直接竞争酶联免疫法的建立
• 3.3.3 样品的基质影响及消除
• 3.3.4 牛奶样品的添加回收
• 3.3.5 dcELISA和HPLC两种检测结果的相关性分析
• 3.4 喹诺酮类药物多残留ELISA检测方法的研究
• 3.4.1 NOR-B抗体直接竞争酶联免疫法的建立
• 3.4.2 样品的基质影响及消除
• 3.4.3 牛奶样品的添加回收
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢