荷叶黄酮的提取、纯化、结构鉴定及其生物活性研究

论文摘要

本文以荷叶为原料，研究了荷叶中总黄酮化合物的提取与纯化工艺。运用化学分析、色谱、光谱及质谱等仪器分析技术和方法，对荷叶中黄酮化合物的结构及其生物活性进行了初步研究。主要研究结果如下：1荷叶黄酮提取工艺条件的优化本试验考察了提取液、浓度、时间、温度和料液比五个单因素对荷叶总黄酮提取率的影响，采用三元二次旋转正交组合设计进行试验，建立了提取温度、提取时间、提取料液比提取工艺参数间的数学模型，方程为Y=67．03+2．68x1+0．16x-2+2．94x3-2．06x1x2-0．43x1x3+0．41x2x3-4．74x12-4．33x22-4．93x32，经计算机模拟寻优确定了用Tween80助提的最佳工艺条件：提取液为1％Tween80，浸提温度74．8～76．5℃、浸提时间38～43min、料液比1：25～1：28。可得最高提取率为59．5％。2荷叶黄酮纯化方法的研究比较5种大孔吸附树脂对荷叶黄酮静态吸附和解吸附能力，并对XAD16型树脂的动态吸附特性进行了研究。XAD16型树脂最佳纯化工艺参数为：上样液浓度1．1mg／mL，流速为1BV／h时，洗脱剂为50％的乙醇溶液，流速为2BV／h进行洗脱，洗脱峰对称性好。采用重结晶的方法进一步纯化荷叶黄酮，其纯度达92％。3荷叶黄酮的结构初步研究采用紫外、红外、质谱、高效液相色谱、气相色谱等分析手段，对荷叶黄酮化合物进行结构分析，推测该化合物结构为异鼠李素-3-O-葡萄糖苷。4荷叶黄酮生物活性研究（1）荷叶黄酮体外抗氧化活性研究分别运用邻苯三酚-鲁米诺、CuSO4-Phen-VC-H2O2和双氧水-鲁米诺化学发光体系测定了荷叶黄酮对超氧阴离子、体外双氧水、羟基自由基的清除作用，采用CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA体系测定了荷叶黄酮对体外DNA损伤的保护作用。实验结果表明荷叶黄酮具有较好的体外清除活性氧和DNA损伤的保护作用。采用比色法检测了荷叶黄酮对动物组织体外抗氧化作用的影响，结果表明荷叶黄酮能够有效地清除羟自由基，抑制由羟自由基引起的脂质过氧化、保护生物膜，减少红细胞溶血，减轻肝线粒体肿胀程度，提示具有很强的抗氧化能力。（2）荷叶黄酮对胰脂肪酶、α-淀粉酶活性的影响研究了荷叶黄酮的浓度、作用时间、酶剂量等对猪胰脂肪酶、α-淀粉酶活性的影响。结果表明：（a）荷叶黄酮抑制猪胰脂肪酶活性是通过间接改变底物乳化来阻碍底物-酶结合达到抑制作用，呈非竞争性抑制；（b）荷叶黄酮对α-淀粉酶活性有抑制作用，且荷叶黄酮粗提物对淀粉酶活性抑制作用大于精制黄酮，提示荷叶黄酮对淀粉酶的抑制作用可能是物质间的协同作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 前言
• 1. 荷叶黄酮的研究概况
• 1.1 荷叶黄酮的化学研究
• 1.2 荷叶黄酮的提取分离
• 1.2.1 热水提取法
• 1.2.2 乙醇/水溶液提取法
• 1.2.3 物理辅助提取法
• 1.2.4 大孔树脂吸附分离法
• 1.2.5 高速逆流色谱分离法
• 1.2.6 其他提取分离技术
• 1.3 荷叶黄酮的测定方法
• 1.3.1 比色法
• 1.3.2 高效液相色谱法
• 1.3.3 其他方法应用展望
• 1.4 荷叶黄酮的生理功能
• 1.4.1 降血脂、减肥作用
• 1.4.2 抑菌作用
• 1.4.3 抗氧化的作用
• 1.4.4 其它作用
• 1.5 荷叶提取物的安全性
• 1.6 荷叶黄酮的开发前景
• 2. 课题构想
• 2.1 本课题研究目的
• 2.2 本课题研究内容
• 2.2.1 荷叶黄酮的提取方法的研究
• 2.2.2 荷叶黄酮的分离纯化与结构鉴定
• 2.2.3 荷叶黄酮抗脂质过氧化作用
• 第二章 荷叶黄酮提取工艺研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 原料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 芦丁标准曲线的制备
• 1.2.2 提取液中荷叶总黄酮含量的测定
• 1.2.3 单因素实验
• 1.2.4 正交试验
• 1.3 数据处理
• 2. 结果与分析
• 2.1 芦丁标准曲线
• 2.2 荷叶总黄酮的单因素提取
• 2.2.1 溶剂种类的筛选
• 2.2.2 Tween80浓度对总黄酮得率的影响
• 2.2.3 提取温度对总黄酮得率的影响
• 2.2.4 提取时间对总黄酮得率的影响
• 2.2.5 荷叶与溶剂质量之比对总黄酮得率的影响
• 2.2.6 粒度对总黄酮得率的影响
• 2.3 二次旋转正交组合设计实验结果及其模型分析与检验
• 2.3.1 提取率数学模型解析
• 2.3.2 提取率模型优化
• 3. 讨论
• 第三章 荷叶黄酮纯化方法的研究
• 1. 材料、试剂与仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 实验仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 树脂的预处理
• 1.2.2 树脂对荷叶黄酮吸附量、吸附率的测定
• 1.2.3 树脂对荷叶黄酮解吸率的测定
• 1.2.4 静态吸附动力学曲线特征
• 1.2.5 动态吸附和动态解吸实验
• 2. 结果与讨论
• 2.1 5种树脂对荷叶黄酮静态吸附量、吸附率比较
• 2.2 静态吸附动力学曲线特征
• 2.3 动态吸附和动态解吸实验
• 2.3.1 上样液浓度
• 2.3.2 pH
• 2.3.3 流速
• 2.3.4 洗脱剂浓度对解吸能力的影响
• 2.3.5 洗脱剂流速对解吸能力的影响
• 2.3.6 动态吸附曲线
• 2.3.7 解吸曲线
• 2.4 杂质的除去
• 2.5 重结晶精制黄酮
• 2.6 黄酮样品纯度的检测
• 2.6.1 灼烧残渣检查
• 2.6.2 澄清度的检测
• 2.6.3 皂甙检查
• 2.6.4 高效液相色谱法检测
• 3. 讨论
• 第四章 荷叶中黄酮类化合物的结构鉴定
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 显色反应
• 1.2.2 紫外光谱检测
• 1.2.3 红外光谱分析
• 1.2.4 HPLC-MS检测
• 1.2.5 液相色谱检测
• 1.2.6 气相色谱检测
• 2. 结果与分析
• 2.1 显色反应
• 2.2 UV检测结果及分析
• 2.3 红外光谱分析
• 2.4 质谱检测
• 2.4.1 高效液相色谱
• 2.4.2 质谱分析结果
• 2.5 高效液相色谱检测
• 2.5.1 水解试验
• 2.5.2 苷元的确定
• 2.6 气相色谱检测
• 3. 讨论
• 第五章 荷叶黄酮的生物活性研究
• 第一节 荷叶黄酮的体外抗氧化活性研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 主要试剂的配制
• 1.5 实验方法
• 1.5.1 荷叶黄酮对超氧阴离子的清除作用
• 1.5.2 荷叶黄酮对羟基自由基的清除作用
• 1.5.3 荷叶黄酮对过氧化氢的清除作用
• 1.5.4 荷叶黄酮抑制DNA氧化损伤的作用
• 1.5.5 对红细胞自氧化溶血的影响
• 2O₂诱导小鼠红细胞氧化溶血的影响'>1.5.6 对H₂O₂诱导小鼠红细胞氧化溶血的影响
• 1.5.7 对小鼠肝匀浆脂质过氧化影响
• 1.5.8 对小鼠肝线粒体脂质过氧化的影响
• 1.6 数据分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 荷叶黄酮对超氧阴离子的清除作用
• 2.2 荷叶黄酮对羟基自由基的清除作用
• 2.3 清除过氧化氢测定
• 2.4 抑制DNA氧化损伤测定
• 2.5 荷叶黄酮对红细胞自氧化溶血的影响
• 2O₂所致的红细胞氧化溶血的影响'>2.6 荷叶黄酮对H₂O₂所致的红细胞氧化溶血的影响
• 2.7 荷叶黄酮对肝匀浆自氧化的影响
• 2O₂诱导肝匀浆脂质过氧化的影响'>2.8 荷叶黄酮对H₂O₂诱导肝匀浆脂质过氧化的影响
• 4系统诱导肝线粒体脂质过氧化的影响'>2.9 荷叶黄酮对VC-FeSO₄系统诱导肝线粒体脂质过氧化的影响
• 4系统诱导肝线粒体肿胀度的影响'>2.10 荷叶黄酮对VC-FeSO₄系统诱导肝线粒体肿胀度的影响
• 3. 讨论
• 第二节 荷叶黄酮对胰脂肪酶、淀粉酶的体外抑制作用
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 荷叶黄酮对胰脂肪酶活性的影响
• 1.4.2 荷叶黄酮对α-淀粉酶活性的影响
• 1.5 数据分析
• 2. 结果分析
• 2.1 荷叶黄酮对胰脂肪酶活性的影响
• 2.1.1 荷叶黄酮粗品与精制黄酮对胰脂肪酶的抑制作用
• 2.1.2 脂肪酶抑制剂浓度对抑制作用的影响
• 2.1.3 反应时间对抑制作用的影响
• 2.1.4 加酶量对抑制作用的影响
• 2.1.5 抑制作用机理和类型
• 2.2 荷叶黄酮对淀粉酶活力的抑制作用
• 3. 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 研究生期间发表的论文