安全选择标记转化小麦体系的建立

论文摘要

随着基因工程的飞速发展,由于转基因农作物可同时具有优质、高产、抗旱、抗盐以及抗除草剂等多重优点,全世界范围内转基因农作物的种类、数量、产量都迅猛增加。而随着转基因作物产品的商品化,人们对转基因植物及以之为原料生产的食品的安全性心存疑虑。究其原因是目前的转化多为抗性标记基因和目的基因一起遗传转化,从而赋予转化细胞抗生素或除草剂等抗性,在选择剂的筛选下,分化形成转基因植物。但一旦转基因植物再生成功,这些标记基因就不再有用,甚至在某种程度上是有害的。故转基因作物中选择标记的安全性问题引起了公众的关注,如何消除选择标记,培育安全选择标记基因的转基因作物已成为基因工程的热点。所以本研究的创新点就是将待转化的目的基因同时作为选择标记基因,以一个基因两种作用的思路对转化的植株进行筛选。具体从研究具有优良农艺性状的基因开发构建安全选择标记载体、建立稳定的农杆菌介导的遗传转化体系及安全选择标记筛选体系建立三个方面入手,期望在基因工程的安全性方面开拓新的思路及方法,同时得到具有安全选择标记的耐盐转基因小麦,以消除公众对转基因作物的安全性顾虑。本研究主要由三部分组成：pBZ1024-TaSTRG表达载体和pBZ1024-Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建,农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化体系建立以及安全选择标记筛选体系建立。论文的第一部分是pBZ1024-TaSTRG表达载体和pBZ1024-Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体的构建。TaSTRG（我室研究证明）和Na+/H+逆向转运蛋白基因（公认的）是受盐诱导表达的,并且在拟南芥、水稻中已经初步证明它们都可以提高植株的抗逆性尤其是在耐盐性方面。故将这两个基因作为选择标记具有两个优点：一、它们均是小麦自身具有的基因,可消除食用是否安全的顾虑；二、它们功能强,表型好,可很好发挥筛选作用。本研究中采用的pBZ1024载体是本室通过对pCAMBIA1300改造获得。首先,将pCAMBIA1300载体上的潮霉素抗性基因去除,从而消除该载体是否安全的顾虑,同时在此位置加入MluI和Eco91I两个酶切位点,以便安全标记基因的插入。其次,将pTCK303载体上的Ubi启动子,多克隆位点和NOS终止子片段连接到改造后的pCAMBIA1300载体上,方便其他基因比如高产、高效及优质等的相关基因插入,为培育多种优质性状的作物奠定基础。将TaSTRG和Na+/H+逆向转运蛋白基因克隆测序正确后,通过转化、酶切和连接等一系列过程最后将构建好的pBZ1024-TaSTRG表达载体和pBZ1024-Na+/H+逆向转运蛋白基因表达载体转入EHA105中以备转化小麦愈伤组织,从而探索安全选择标记的可行性。论文的第二部分是农杆菌介导的小麦成熟胚愈伤遗传转化体系的建立。由于农杆菌介导的遗传转化在小麦中有一定的局限性,故对于转化体系方面的研究主要是集中在成熟胚愈伤诱导条件的优化,农杆菌侵染液浓度和时间的确定,共培养温度和时间的选择,分化效率的提高等。对于师栾02-1这个小麦品种比较适合的农杆菌侵染液浓度和时间进行相关探索,菌液浓度在0.1,侵染时间为0.5h,效率比较高。同时为了消除褐化对转化愈伤组织分化的影响,探索谷氨酰胺在诱导分化消除褐化方面的影响。通过本研究的探索同时结合现有的文献及我室前期工作,成熟胚诱导率已经可以达到较高的水平。论文第三部分是安全选择标记筛选体系建立。对师栾02-1这个基因型适合的盐筛选浓度进行探究,通过大量数据分析得出0.5%盐筛选,既可以最大程度发挥筛选作用,又可以提高后面愈伤组织分化苗的几率。同时将转化后的小麦师栾02-1的成熟胚在无盐和有盐筛选下的可分化的愈伤组织进行相关统计,数据分析表明通过盐筛选可以减少后期的工作量。最后对转基因植株进行PCR鉴定,结果表明,目的基因已经成功转入小麦中目前以耐盐基因为小麦转化筛选标记的报道还不多,为了更好的解决转基因的安全性,因此,我们尝试将安全抗逆标记基因应用到小麦的遗传转化中,并且已经初步建立了安全选择标记的筛选体系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 1 盐对植物的伤害及植物耐盐机理
• 1.1 盐对植物的伤害
• 1.2 植物耐盐机理
• 2 小麦的遗传转化
• 2.1 基因工程与小麦遗传改良概述
• 2.2 农杆菌介导小麦遗传转化的概述
• 3 转基因植物的安全性
• 3.1 转基因植物的安全因素及应对策略的概述
• 3.2 去除选择标记基因策略概述
• 4 小麦耐盐基因TASTRG功能研究
• +/H⁺逆向转运蛋白基因功能研究'>5 小麦耐盐基因NA⁺/H⁺逆向转运蛋白基因功能研究
• 6 本研究的目的意义
• 7 本研究的技术路线
• 第二篇 研究论文
• 第一章 安全选择标记载体的构建与优化
• 1 实验材料
• 1.1 菌种、质粒
• 1.2 主要化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 2 实验方法
• 2.1 pBZ1024-TaSTRG载体的构建
• +/H⁺逆向转运蛋白基因载体的构建'>2.2 pBZ1024-Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因载体的构建
• 3 结果分析
• 3.1 TaSTRG基因的PCR扩增
• 3.2 pBZ1024-TaSTRG载体的构建
• 3.3 pBZ1024-TaSTRG表达载体的农杆菌转化与鉴定
• +/H⁺逆向转运蛋白基因的PCR扩增'>3.4 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的PCR扩增
• +/H⁺逆向转运蛋白载体的构建'>3.5 pBZ1024-Na⁺/H⁺逆向转运蛋白载体的构建
• +/H⁺表达载体的农杆菌转化与鉴定'>3.6 pBZ1024-Na⁺/H⁺表达载体的农杆菌转化与鉴定
• 4 讨论
• 第二章 农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化体系的建立
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 质粒与菌株
• 1.3 主要试剂与仪器
• 2 试验方法
• 2.1 培养基
• 2.2 小麦师栾02-1成熟胚愈伤组织的遗传转化过程
• 2.3 农杆菌介导的小麦师栾02-1的遗传转化体系的确立
• 3 结果与分析
• 3.1 小麦师栾02-1成熟胚愈伤组织的诱导
• 3.2 农杆菌转化时侵染浓度及时间的确立
• 3.3 分化培养基激素及谷氨酰胺的选择
• 4 讨论
• 4.1 小麦成熟胚的诱导体系的建立
• 4.2 农杆菌介导的转化体系的建立
• 4.3 愈伤组织分化培养的优化
• 第三章 安全选择标记筛选体系建立
• 1 实验材料
• 2 实验过程
• 2.1 农杆菌介导的愈伤组织转化后进行无盐及有盐筛选
• 2.2 转化安全标记基因的愈伤组织盐筛选浓度的体系的建立
• 2.3 转基因植株的PCR鉴定
• 3 实验结果
• 3.1 转化安全标记基因的愈伤组织盐筛选浓度的体系的建立
• 3.2 农杆菌介导的愈伤组织转化后进行无盐及有盐筛选
• 3.3 安全选择标记的表达载体转化结果统计
• 3.4 转基因植株的PCR鉴定
• 4 讨论
• 4.1 盐筛选的时间及筛选压的探讨
• +/H⁺逆向转运蛋白基因表达载体的应用'>4.2 构建的pBZ1024-TaSTRG和pBZ1024-Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因表达载体的应用
• 4.3 转基因植株的鉴定及安全标记载体的应用
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢