论文摘要
背景尽管现代医学已经取得了巨大的进步,但是卵巢恶性肿瘤的发病率和死亡率仍居高不下。人类基因组图谱的绘制以及人类基因组研究的蓬勃兴起,为从源头上防治恶性肿瘤提供了新的途径。近期的大量研究表明,人类基因组中与细胞增殖分化相关癌基因的激活和抑癌基因的失活与恶性肿瘤的发生、发展密切相关,在此基础上出现了对恶性肿瘤进行基因治疗的理论和实践探索。寻找和确定有治疗意义的目的基因是实施肿瘤基因治疗的前提。RNA干扰（RNA interfering,RNAi）是一种由长约21-23个核苷酸的双链RNA分子（double-stranded RNA, dsRNA）引起的转录后基因沉默,以序列特异的方式抑制同源基因的表达,其副作用小,特异性高。RNAi是生物界普遍存在的一种调控基因表达的有效方式和鉴定基因功能的重要手段,具有高效特异阻断基因表达的特点,在基因功能研究、信号转导通路研究以及基因治疗中得到广泛的应用。近年来,小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）在肿瘤基因治疗方面取得了重大进展。通过向肿瘤细胞内导入能稳定表达siRNA分子的质粒或病毒载体来研究特定癌基因或抑癌基因的功能。Her-2基因又称C-erbB-2,其编码的蛋白产物p185该蛋白产物在人类肿瘤中因基因扩增或转录异常而导致过度表达,是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）亚群的成员之一,对肿瘤细胞的生长、分化起着重要的作用,且与肿瘤的化疗敏感性呈显著的负相关。我们设想通过RNAi在转录水平上实现对卵巢癌细胞中Her-2表达水平的调控,观察该方法对卵巢癌细胞生物学特征的影响,从而为将来该方法在临床上的应用提供理论和实验依据。目的探讨利用逆转录病毒载体介导的siRNA能否有效的介导肿瘤细胞出现RNAi现象,观察其对Her-2基因表达的抑制作用和对人卵巢癌细胞株SKOV3生物学行为的影响。方法①设计、构建及鉴定Her-2/siRNA、Her-2/siRNA-negative重组逆转录病毒表达载体。②Her-2/siRNA、Her-2/siRNA-negative重组载体在脂质体介导下转染到包装病毒细胞株PT67中,嘌呤霉素筛选并挑选细胞克隆。收获的病毒上清液转染人卵巢癌细胞株SKOV3,经过嘌呤霉素筛选得到稳定转染的细胞株SKOV3/siRNA、SKOV3/siRNA-negative。通过RT-PCR和免疫组化方法鉴定Her-2表达的抑制效果。③通过MTT检测细胞增殖以及对顺铂的敏感性,通过流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡。④将稳定转染的细胞株SKOV3/siRNA、SKOV3/siRNA-negative及SKOV3种植到裸鼠皮下检测成瘤情况,并观察NK-92细胞对其杀伤作用。结果①成功构建Her-2/siRNA、Her-2/siRNA-negative重组逆转录病毒表达载体。②建立了稳定抑制Her-2基因表达的细胞株SKOV3/siRNA和对照组SKOV3/siRNA-negative,SKOV3/siRNA组细胞Her-2基因表达为对照组的38.4%,免疫组化结果显示Her-2基因表达受到较强抑制。③SKOV3/siRNA细胞株的G0/G1期细胞占（68.6±10.3）%, S期细胞占（15.1±1.2 ）%,G2/M期占（11.4±1.4）%;而SKOV3/siRNA-negative细胞株的G0/G1期细胞则占（55.8±9.1）%, S期细胞占（23.3±1.5）%,G2/M期占（18.1±1.7）%。④SKOV3/siRNA细胞株早期凋亡（10.500±0.250）%、SKOV3/siRNA-negative细胞株早期凋亡（0.340±0.010）%,两者比较,差异有显著性（p<0.01）。⑤MTT检测结果显示SKOV3/siRNA组细胞增殖较SKOV3/siRNA-negative明显下调（p<0.05）,接种于裸鼠皮下的肿瘤生长明显减慢（p<0.01）。⑥对顺铂的耐药性研究:在DDP作用下SKOV3/siRNA细胞存活率在4d时为（66.4±3.3）%,与对照组（81.7±1.3）%比较差异有显著性（p<0.05）。FCM分析显示SKOV3/siRNA细胞的DDP诱导凋亡率为（42.8±1.4）%,明显高于对照组组（8.8±0.7）%,差异有显著性（p<0.01）。⑦NK细胞杀伤的研究:NK-92在效靶比1 :20时对SKOV3/siRNA-negative、SKOV-3/siRNA细胞杀伤率分别为（21.1±6.8）%和（45.5±8.9）%（p<0.05）,SKOV-3/siRNA细胞接种在裸鼠皮下形成的肿瘤生长速度慢于SKOV3/siRNA-negative （p<0.05）,在NK-92治疗后其肿瘤生长速度显著减慢（p<0.05）。结论①由逆转录病毒载体介导的siRNA可以有效抑制Her-2基因的表达。②抑制卵巢癌细胞株SKOV3细胞的Her-2基因表达后,卵巢癌细胞株SKOV3恶性生物学行为明显受抑。③抑制卵巢癌细胞株SKOV3细胞的Her-2基因表达后,卵巢癌细胞株SKOV3对顺铂的敏感性增加。④抑制卵巢癌细胞株SKOV3细胞的Her-2基因表达后,可以增强NK-92细胞对SKOV3细胞在体内和体外的杀伤活性。因此,抑制Her-2基因的表达可以影响卵巢癌细胞株SKOV3的恶性生物学行为,提高顺铂药物敏感性,提高NK-92细胞的杀伤活性,NK-92细胞联合靶向Her-2基因的siRNA有望成为卵巢肿瘤治疗的新途径。
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