转抗虫基因小黑杨叶片凋落物对土壤生态系统的影响

论文摘要

随着全世界转基因植物种植的普及,转基因植物对生态环境的影响也受到人们的广泛关注。而土壤生态系统是整个生态系统的重要组成部分,因此,本文针对转Bt-蜘蛛神经毒肽蛋白融合基因小黑杨对土壤微生物结构、土壤酶活性、土壤理化性质的影响以及外源基因的水平转移的可能性进行初步研究,为系统评价转基因植物释放可能引起的生态环境风险提供有用的信息,也为今后进一步的研究提供参考。本试验利用叶片土壤埋藏法,采用PCR技术,对转基因小黑杨中目的基因（转蜘蛛神经毒肽蛋白和Bt基因）及标记基因（NPTⅡ基因）在土壤中的残留进行了研究。结果发现埋入土壤中的转基因小黑杨叶片凋落物中的目的基因（转蜘蛛神经毒肽蛋白和Bt基因）和标记基因（NPTⅡ基因）的DNA片段最多可以存在60d和90d,超过120d后目的基因及标记基因均无法检测到。本研究对叶片凋落物叶际周围可培养5大类土壤微生物——细菌、放线菌、真菌、固氮菌和纤维素分解菌进行分离,并分别计数,研究转基因小黑杨叶片凋落物降解过程中对叶际周围微生物的影响,同时设非转基因小黑杨及空白土壤对照,试验初步证明转基因小黑杨叶片凋落物对土壤真菌和纤维素分解菌数量有显著影响（P＜0.05）。此外,从6个不同降解时期土壤微生物总量的比例来看,总体以细菌数量最多,因此,细菌是本研究中土壤微生物中的优势菌群。转基因小黑杨叶片凋落物降解后,与对照相比两种林型中转基因处理的土壤细菌NPTⅡ抗性基因PCR阳性检测都有不同程度的提高,从降解前的6.67%——12.5%提高到降解后的41.67%——58.46%之间,两者间差异达到显著水平（P＜0.05）。在对目的基因（转蜘蛛神经毒肽蛋白和Bt基因）进行PCR阳性检测中发现,仅在阔叶林土壤细菌中检测到个别的阳性结果,其PCR阳性结果百分比仅为1.92%——3.08%,这说明极少数目的基因可能发生了水平转移;同时,Southerh杂交结果进一步证实这一结论。本研究发现,将转基因小黑杨叶片降解处理的土壤与对照土壤相比,除针叶林土中的磷酸酶和脲酶外,两种林型的多酚氧化酶,以及阔叶林的土壤磷酸酶和脲酶差异均达到显著或极显著水平（P＜0.05或P＜0.01）,这可能说明土壤酶活一定程度上受到了转基因小黑杨叶片的影响。而在土壤养分方面,埋入转基因及对照叶片半年后除土壤有效磷外,其余土壤pH值、全氮、水解氮、有机质、土壤可溶性有机碳和可溶性有机氮等土壤养分指标与对照之间差异均未达到显著性水平,仅对有效磷略呈负面影响,因此本研究认为转基因小黑杨叶片凋落物的降解在短期内对土壤主要养分的影响是很小的。但长期种植转基因小黑杨是否会对对土壤养分造成影响还进一步探讨。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 转基因植物带来的潜在风险
• 1.2.1 转基因植物的外源基因向非转基因植物的逃逸
• 1.3 转基因植物对根际土壤生态系统的影响
• 1.3.1 转基因植物生物量的土壤降解
• 1.3.2 转基因植物对土壤理化性质的影响
• 1.3.3 目的基因在土壤中存在状态
• 1.3.4 转基因植物对土壤生物的影响
• 1.4 研究目的和意义
• 1.5 技术路线
• 2 转基因小黑杨目的基因及标记基因的降解情况
• 2.1 试验材料与设计
• 2.2 试验内容和方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 本章小结
• 3 转基因小黑杨叶片凋落物土壤降解对微生物数量的影响
• 3.1 试验设计
• 3.2 试验内容及方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 本章小结
• 4 转基因小黑杨外源基因在土壤中的水平转移
• 4.1 试验设计
• 4.2 试验内容和方法
• 4.2.1 细菌培养
• 4.2.2 目的基因及报告基因的提取及PCR检测
• 4.2.3 Sourthern杂交
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 叶片降解后土壤中Kan抗性克隆数及对照数量统计
• 4.3.2 转基因小黑杨目的基因及报告基因水平转移的PCR检测
• 4.3.3 转基因小黑杨目的基因及报告基因水平转移的Sourthern-bloting检测
• 4.4 本章小结
• 5 转基因小黑杨叶片凋落物的降解对土壤酶活性的影响
• 5.1 试验设计
• 5.2 试验试剂
• 5.3 试验方法
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 转基因小黑杨凋落物降解前后土壤多酚氧化酶活性比较
• 5.4.2 转基因小黑杨凋落物降解前后土壤脲酶活性比较
• 5.4.3 转基因小黑杨凋落物降解前后土壤磷酸酶活性比较
• 5.4.4 降解前后土壤三种酶指标的变化特征
• 5.5 本章小结
• 6 转基因小黑杨叶片凋落物的降解对土壤养分的影响
• 6.1 试验设计
• 6.2 试验试剂
• 6.3 试验方法
• 6.4 结果与分析
• 6.4.1 转基因小黑杨叶片凋落物降解前后土壤pH值比较
• 6.4.2 转基因小黑杨叶片凋落物降解前后土壤有效磷、水解性氮及全氮含量比较
• 6.4.3 转基因小黑杨凋落物降解前后土壤有机质含量比较
• 6.4.4 转基因小黑杨凋落物降解前后土壤C/N比较
• 6.4.5 转基因小黑杨叶片凋落物降解前后土壤可溶性有机碳及可溶性有机氮的比较
• 6.4.6 降解前后土壤几项养分指标的变化特征
• 6.4.7 土壤微生物与土壤理化指标间的相关分析
• 6.4.8 土壤养分与土壤酶的通径分析
• 6.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢