AtPPR2基因在拟南芥配子体和胚胎发育中的功能分析

论文摘要

被子植物的生活周期经历了从二倍体孢子体世代到单倍体配子体世代的交替过程,该过程是通过配子体发育、双受精形成合子、胚胎发育而实现的。研究雌雄配子体及胚胎发育过程,对了解被子植物的生活周期及其分子机制具有重要的意义。在模式植物拟南芥中,很多与雌雄配子体发育或（和）胚胎发育相关的突变体已经被发现和鉴定。PPR蛋白质是一类主要定位在线粒体或质体/叶绿体中的蛋白质,通常由35个简并氨基酸重复序列串联组成。PPR蛋白质家族是植物中最大的蛋白质家族之一,例如:拟南芥基因组编码466个PPR蛋白质,而水稻中存在多达480个PPR蛋白质。PPR基因突变后会导致植物产生各种各样的表型,包括光合作用受损、细胞质雄性不育、胚胎纯合致死、种子不能正常成熟等,这些都表明了PPR基因参与各种各样的生物学过程。对PPR基因分子机制的深入研究,其结果表明大多数PPR蛋白质参与RNA转录后加工,包括RNA编辑、剪接、稳定和翻译。拟南芥AtPPR2是PPR蛋白质家族中的一员。已有的研究结果初步表明,拟南芥AtPPR2基因突变后导致雌雄配子体败育并且胚胎纯合致死,但是AtPPR2基因的确切功能还未见报道。在本论文研究中,利用TAIL-PCR技术鉴定出AtPPR2基因的功能缺失突变体—Atppr2。在Atppr2雌、雄配子体发育过程中,因细胞第一次有丝分裂受阻而导致雌、雄配子体部分败育;在Atppr2胚胎发育过程中,细胞分裂迟缓、无规律,最终导致纯合胚胎败育致死。emb2750突变体是AtPPR2基因中的另一个T-DNA插入突变体。该突变体胚胎的发育具有和Atppr2胚胎发育相似的表型,但是其雌、雄配子体发育正常,表明emb2750突变体很可能是一个弱等位基因突变体。多数emb2750纯合体种子能在含有3%蔗糖的1/2MS培养基上萌发后形成白化苗,这些白化苗表型异常,并且在种子萌发后7天停止生长,最后干枯致死。白化苗的叶绿体高度液泡化,并且缺少典型的叶绿体结构和类囊体膜系统。此外,AtPPR2基因在emb2750白化苗中的表达量约是野生型中的60%,在emb2750突变体中很可能存在一个具有部分功能的不完整转录本。在遗传互补实验中,AtPPR2全基因能够互补Atppr2和emb2750的表型。Real-time PCR和GUS报告基因的方法检测AtPPR2基因的表达模式,发现AtPPR2基因在根、茎、叶、幼苗、花、角果等各个组织都有表达,其中在细胞分裂旺盛的部位表达量较高。烟草瞬时表达和拟南芥原生质体瞬时表达AtPPR2N-EYFP融合蛋白实验,都证明AtPPR2蛋白质定位在叶绿体中。RNA共沉淀实验和蛋白质凝胶迁移滞后实验,均证明AtPPR2蛋白可以与叶绿体基因组编码的23S rRNA结合。AtPPR2可能通过调控蛋白质翻译过程而精细调控质体/叶绿体功能,进而调控细胞分裂。目前已报道的叶绿体基因,主要参与叶绿体发育和光合作用。虽然光合作用对胚胎和配子体发育并不是必需的,但是质体/叶绿体中的一些主要代谢物质,例如氨基酸、脂肪酸、维生素、植物激素等,都可能是胚胎和配子体发育所必需的。因此,当AtPPR2丧失生物学功能后,突变体的质体/叶绿体常见功能将会发生紊乱,从而导致Atppr2部分雌雄配子体和胚胎（emb2750胚胎）发育上的缺陷。总之,对AtPPR2基因分子机制的深入研究,将为“质体/叶绿体在细胞分裂中起着重要的作用”这一论点提供新的证据,开拓新的视野。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 拟南芥雄配子体的发育过程
• 1.1.1 小孢子母细胞减数分裂形成小孢子
• 1.1.2 小孢子发育为成熟花粉粒
• 1.1.3 拟南芥雄配子体发育的分子机制
• 1.2 拟南芥雌配子体的发育过程
• 1.2.1 大孢子母细胞减数分裂形成大孢子
• 1.2.2 大孢子发育为成熟胚囊
• 1.2.3 拟南芥雌配子体发育的分子机制
• 1.3 拟南芥胚胎发育过程及其分子机制
• 1.3.1 拟南芥的胚胎发育过程
• 1.3.2 拟南芥胚胎发育的分子机制
• 1.4 PPR 蛋白质和emb 突变体
• 1.4.1 PPR 蛋白质的结构与功能
• 1.4.2 emb 突变体的研究进展
• 1.5 叶绿体的结构与功能
• 1.6 雄性不育及其在苜蓿育种上的应用
• 1.6.1 雄性不育的特点
• 1.6.2 雄性不育在苜蓿育种上的应用
• 1.7 立题依据及研究意义
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料、菌株及质粒载体
• 2.1.2 常用试剂和引物
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥的种植
• 2.2.2 拟南芥总基因组DNA 的提取（2XCTAB 法）
• 2.2.3 热不对称交错聚合酶链反应（TAIL-PCR）
• 2.2.4 DNA 的琼脂糖凝胶回收
• 2.2.5 DNA 片段与Zero Blunt? TOPO? PCR 克隆载体或双元载体的连接反应
• 2.2.6 大肠杆菌DH5α感受态的制备及热激转化
• 2.2.7 大肠杆菌质粒的提取
• 2.2.8 农杆菌GV3101 感受态的制备及热激转化
• 2.2.9 拟南芥的农杆菌侵染转化
• 2.2.10 转基因植株的筛选
• 2.2.11 TRIZOL 法提取拟南芥总RNA
• 2.2.12 反转录和荧光实时定量PCR （Real-time PCR）
• 2.2.13 Northern 杂交
• 2.2.14 突变体与野生型的正反交实验
• 2.2.15 GUS 染色观察
• 2.2.16 花药的石蜡切片
• 2.2.17 花粉的DAPI 染色
• 2.2.18 拟南芥胚胎和胚珠的透明观察
• 2.2.19 扫描电子显微镜观察
• 2.2.20 拟南芥原生质体的转化与瞬间表达
• 2.2.21 烟草叶片细胞的转化与瞬时表达
• 第三章 AtPPR2 在配子体和胚胎发育中的功能分析
• 3.1 Atppr2突变体的分离和基因鉴定
• 3.2 Atppr2突变体的表型分析及遗传互补实验
• 3.2.1 Atppr2是一个胚胎纯合致死突变体
• 3.2.2 Atppr2突变体影响雌、雄配子体的发育
• 3.2.3 Atppr2突变体阻止雌、雄配子体的第一次有丝分裂
• 3.2.4 Atppr2胚胎在球型胚时期出现异常,其细胞分裂迟缓、无规律
• 3.2.5 遗传互补试验证明At3g06430基因能够互补Atppr2的表型
• 3.3 emb2750突变体的表型分析及遗传互补实验
• 3.3.1 emb2750突变体影响了胚胎发育但是没有影响配子体发育
• 3.3.2 emb2750胚胎的表型与Atppr2胚胎相似,但败育程度较轻
• 3.3.3 emb2750种子能在培养基上萌发成白化苗
• 3.3.4 遗传互补试验证明At3g06430基因能够互补emb2750突变体的表型
• 3.4 AtPPR2 基因的表达模式
• 3.5 AtPPR2 蛋白是一个叶绿体蛋白
• 3.6 AtPPR2与叶绿体23SrRNA结合,可能在翻译水平上起着调控作用。
• 3.6.1 AtPPR2蛋白质与叶绿体23SrRNA结合
• 3.6.2 AtPPR2 可能在翻译水平上起着调控作用
• 第四章 讨论、结论与展望
• 4.1 讨论
• 4.2 结论与展望
• 参考文献
• 附录：本文所用引物列表
• 致谢
• 作者简历