农杆菌介导的玉米醇溶蛋白基因转化紫花苜蓿的研究

论文摘要

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上最重要的多年生豆科牧草,被誉为“牧草之王”。然而,豆科牧草中含硫氨基酸（SAAs）含量很低。含硫氨基酸（SAAs）对动物产毛和产奶的质量影响很大,饲料中补充SAAs,可使羊毛生长和毛中含硫量均显著增加,或提高奶牛产奶量和乳汁中的蛋白含量。利用基因工程手段将富硫蛋白基因转入紫花苜蓿,提高牧草蛋白中含硫氨基酸水平具有十分重要的意义。10KD玉米醇溶蛋白中含硫氨基酸占20%之多,是目前发现的含硫氨基酸含量最高的一种蛋白。其具有在反刍动物瘤胃中稳定而在肠中降解的特性,可作为改良紫花苜蓿品质的候选基因。而融合内质网驻留蛋白信号后,可以显著提高该蛋白在转化植株中的稳定性。本实验将与KDEL融合的10KD玉米醇溶蛋白基因（10KD zein:KDEL）通过农杆菌介导转化紫花苜蓿,以提高苜蓿中的含硫氨基酸水平。根据该基因的保守序列设计引物,并在下游引物终止密码子前引入内质网驻留蛋白信号序列（KDEL）,通过PCR技术从玉米（Zea mays L.）黄化幼苗基因组中扩增目的基因的开放阅读框。基因全长465bp,编码154个氨基酸,含硫氨基酸共占24.03 %。并将该基因构建到植物表达载体上。建立紫花苜蓿的组织培养再生体系。以子叶和下胚轴为外植体,培养基为改良SH +KT 1.5 mg/L+ NAA3.0 mg/L+肌醇100 mg/L +CH250 mg/L的培养基,外植体在该培养基上培养2个月左右直接出芽。生根培养基为MSO培养基。通过冻融法将植物表达载体转化入农杆菌EHA105中。建立紫花苜蓿的转化体系。确定除菌的最佳抗生素是Carb200mg/L,下胚轴和子叶适宜的抗生素筛选浓度均为Hrg10mg/L。通过农杆菌介导转化紫花苜蓿,PCR检测证实外源基因已经转入紫花苜蓿中。将富硫的10KD玉米醇溶蛋白基因转入紫花苜蓿,获得的转基因植株弥补了苜蓿缺乏含硫氨基酸的不足,为提高紫花苜蓿品质、改善反刍动物氨基酸营养结构奠定了研究基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1 紫花苜蓿基因工程研究进展
• 1.1 常用的植物遗传转化技术
• 1.2 苜蓿组织培养研究进展
• 1.3 苜蓿基因工程研究进展
• 2 硫在反刍动物营养中的作用
• 2.1 反刍动物中硫的生理功能
• 2.2 反刍动物利用硫的途径
• 3 富硫蛋白及基因研究进展
• 3.1 醇溶蛋白（prolamin）
• 3.2 清蛋白（Albumin）
• 3.3 植物凝集素（Phytoagglutinin）
• 3.4 硫堇（Thionin）
• 4 蛋白质分选与内质网驻留蛋白信号肽
• 4.1 信号假说（signal hypothesis）
• 4.2 典型的蛋白质分选信号
• 4.3 KDEL 信号肽作用机理
• 5 研究意义
• 第一章 10KD 玉米醇溶蛋白基因的克隆与植物表达载体构建
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 玉米基因组DNA 的提取
• 1.2.2 PCR 扩增10KD 玉米醇溶蛋白基因序列
• 1.2.3 PCR 反应产物的回收
• 1.2.4 目的基因的亚克隆
• 1.2.5 重组子的筛选
• 1.2.6 序列测定及分析
• 1.2.7 植物表达载体的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 玉米基因组DNA 提取
• 2.2 10KD 玉米醇溶蛋白基因PCR 扩增
• 2.3 碱裂解法小量制备重组子质粒
• 2.4 重组子的双酶切鉴定和PCR 鉴定
• 2.5 序列测定及预测的氨基酸序列
• 2.6 序列同源性分析
• 2.7 质粒CA-zei1110 的双酶切鉴定
• 3 讨论
• 第二章 紫花苜蓿组织再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 种子消毒方式及时间的选择
• 1.2.2 无菌苗的获得
• 1.2.3 培养环境
• 1.2.4 愈伤组织诱导培养基的选择
• 1.2.5 外植体的选择
• 1.2.6 分化培养
• 1.2.7 继代培养
• 1.2.8 生根培养
• 2 结果与分析
• 2.1 种子消毒方式及时间的选择
• 2.2 直接出芽培养基的选择
• 2.3 外植体类型对组织培养的影响
• 2.4 丛生芽生根
• 3 讨论
• 3.1 不同品种对组织再生的影响
• 3.2 植物组织培养中褐变的发生及防止途径
• 第三章 紫花苜蓿的转化及分子生物学检测
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 农杆菌的转化及鉴定
• 1.2.2 抗生素抑菌浓度的确定
• 1.2.3 Carb 对外植体分化的影响
• 1.2.4 Hyg 选择压力的确定
• 1.2.5 紫花苜蓿的转化
• 1.2.6 再生植株的分子检测
• 2 结果与分析
• 2.1 碱裂解法提取农杆菌转化子质粒DNA
• 2.2 农杆菌的PCR 鉴定
• 2.3 Carb 和Cef 抑菌浓度的确定
• 2.4 Carb 对外植体分化的影响
• 2.5 Hyg 选择压力的确定
• 2.6 再生植株的获得
• 2.7 再生植株的PCR 检测结果
• 3 讨论
• 3.1 基因型对转化效率的影响
• 3.2 农杆菌菌株对转化的影响
• 3.3 共培养对转化的影响
• 3.4 选择方法和选择时间对转化的影响
• 3.5 转基因植株中选择标记的去除
• 结论
• 参考文献
• 主要英文缩略词表
• 在读期间发表论文清单
• 致谢