论文摘要
细小病毒是严重危害养猪业的重要病毒。经典的猪细小病毒主要引起猪繁殖障碍。但随着现代病毒学研究技术的快速发展,新的猪细小病毒被不断发现,尤其是最近两年发现的猪Hokovirus （PHoV）和猪博卡样病毒（Porcine Boca-like virus）,引起了兽医科研工作者的极大兴趣。对于猪Hokovirus,目前仅有少数几个国家或地区的流行病学资料以及不足10株病毒的全基因组序列,猪Hokovirus在我国的流行情况如何以及该病毒的遗传变异等也不是很清楚；而对于猪博卡样病毒,目前国际上还没有全基因组序列的报告,该病毒是否属于博卡病毒尚需从全基因组水平上进一步的证实。为了从全基因组水平确定猪博卡样病毒的分类,同时调查我国猪Hokovirus和猪博卡样病毒的流行情况,本研究从PCR诊断方法的建立、流行病学调查和基因组序列分析等方面开展了研究,具体内容如下：1.PHoV诊断方法的建立、分子流行病学调查和基因组序列分析参考猪Hokovirus （PHoV） HK7株（GenBank accession number EU200677）的基因组序列,设计了一对扩增PHoV VP1基因的保守区域352bp片段的特异性引物,建立了检测PHoV的PCR诊断方法。试验证实该方法特异性良好,敏感性高,重复性良好。用建立的PCR检测方法对华中地区PHoV的流行情况进行了调查,结果显示所检测的454份样品中有123份为PHoV阳性,阳性率达27.09%。设计涵盖PHoV基因组编码区的7对引物,分7段扩增获得了广西（GX株）、湖北（HB株）、湖南（HN株）的3份阳性样品的全基因组序列片段。利用Seqman软件将全部序列进行拼接,组成PHoV GX株、PHoV HB株、PHoV HN株的全基因组序列。结果表明：PHoV GX株、PHoV HB株和PHoV HN株基因组全长分别为5080nt、5080nt和5084nt。与国际参考毒株HK7株相比,3株国内分离株的编码区均不存在碱基的插入与缺失,但PHoV HN株在ORF1至ORF2处的非编码区存在4个碱基的插入或缺失。PHoV GX株,PHoV HB株和PHoV HN株和其它的猪Hokovirus参考株的系统进化树分析结果显示,PHoV的系统进化树形成两个分支,我国的PHoV流行毒株序列在一个分支上,而与德国分离株关系相对较远。对不同PHoV毒株之间的NS1基因核苷酸序列分析结果显示：核苷酸同源性为97.2%-100%,氨基酸同源性为97.8%-100%。对PHoV之间的VP1/2基因核苷酸序列分析结果显示：核苷酸同源性为98.1%-99.7%,氨基酸同源性为99.1%-100%。以上结果表明PHoV NS1和VP1/2基因均具有高度的保守性,且VP1/2基因的保守性稍高于NS1基因。2.PBoV诊断方法的建立、分子流行病学调查和基因组序列分析参考国际上报道的猪博卡样病毒的部分序列和检测方法,设计了一对针对猪博卡样病毒保守序列的PCR引物。该引物能特异性扩增496 bp的DNA片段。利用建立的猪博卡样病毒的PCR检测方法,对从华中地区采集的466份样品进行了检测,结果显示199份为阳性,阳性率高达42.7%,表明华中地区猪博卡样病毒的感染率相当高,应该引起养猪业的重视。由于目前尚无猪博卡样病毒的全基因组序列报道,本研究通过设计简并引物并采用重叠延伸法,分4段获得了猪博卡样病毒WH1株的完整编码区序列。序列分析结果显示：猪博卡样病毒WH1株的序列长为4786bp （GenBank accession number HQ223038）。与其它已知的博卡病毒,包括入博卡病毒（HBoV）、猩猩博卡病毒（GBoV）、牛细小病毒（BPV）和犬微小病毒（CnMV）的同源性分别为44%-48%（HBoV）、50%（GBoV）、44%-45%（BPV）、52%-55%（CnMV）。系统进化树分析表明：猪博卡样病毒与CnMV、BPV、GBoV和HBoV等博卡病毒有着共同的进化起源,而且猪博卡样病毒与CnMV遗传距离最近,处于同一系统进化树分支内。根据猪博卡样病毒的全基因组序列和进化分析,证实WH1株为猪博卡病毒（PBoV）。利用GENSCAN软件对PBoV基因组DNA结构进行分析,发现PBoV的基因组由三个开放性阅读框ORF组成,ORF1编码非结构蛋白NS1,ORF2编码结构蛋白VP1/VP2, ORF1与ORF2之间的ORF3编码博卡病毒特有的NP1蛋白。PBoV NS1基因结构与HBoV NS1基因结构类似,都含有比较保守的选择性剪切和拼接位点,推测PBoV在宿主细胞内可能会表达两种NS蛋白。