河南省呼吸道合胞病毒分子生物学研究

论文摘要

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）简称合胞病毒,是重要的婴幼儿急性呼吸道感染病原体,可引起间质性肺炎及毛细支气管炎等疾病。RSV感染非常普遍,超过90%的儿童在2岁以前感染过RSV,而且都经历过1次或多次感染。在发展中国家,5岁以下儿童因RSV感染住院病人的死亡率为7%,发达国家为0.5%～2.0%。我国RSV感染研究缺乏全国资料,部分地区资料显示,北京市儿童医院研究显示在1996～1999年期间,住院的病人中有呼吸道感染症状病例1183例,RSV阳性者标本255例,占送检标本总数的21.5%;沈阳地区1999～2000年调查显示小儿急性呼吸道感染病例的44.62%由RSV引起。我省尚未开展RSV感染的病原学研究,仅仅开展了RSV-IgM抗体的检测工作,也没有对于婴幼儿急性呼吸道感染病例的病原学流行趋势的研究。为了了解河南省婴幼儿急性呼吸道感染病例病原学分布状况,探讨呼吸道合胞病毒在我省的流行规律,积累呼吸道合胞病毒毒株,了解呼吸道合胞病毒黏附蛋白G基因的分子生物学特征,确定我省呼吸道合胞病毒分离株的型别,从而填补我省呼吸道合胞病毒病原学研究的空白,我们设立并开展了此项研究工作。另外,通过对呼吸道合胞病毒各种检测、鉴定方法的对比,比较各种检测方法检测效果的差异,在寻找呼吸道合胞病毒快速检测方法、建立应急检验平台等突发公共卫生事件的预防控制工作方面,提供可靠的实验室数据支持。材料与方法研究对象来源于2006年10月-2007年5月期间河南省人民医院儿科门诊和住院病例,以及河南省流感样病例监测系统中的病例,对诊断为急性支气管炎、毛细支气管炎、肺炎,符合筛选条件的病例确定为研究对象。对研究对象进行调查并采集咽拭液标本,选择Hep-2、Vero细胞系,采用组织培养的方法在咽拭液标本中分离培养呼吸道合胞病毒株,运用相关试剂盒提取咽拭液标本RNA模板,采用Ag-ELISA、real-time PCR等方法鉴定呼吸道合胞病毒。设计并合成针对RSV黏附蛋白G基因的上下游引物,对鉴定阳性病例运用RT-PCR方法扩增该基因,阳性扩增产物运用核苷酸测序方法获得G基因全长核苷酸序列,将所获得的序列与已知参考毒株G基因序列一同导入DNASTAR软件,进行同源性分析和系统进化树分析。运用卡方检验等相关统计学方法比较各检测方法的敏感性差异,结合实际工作,找出快速实用的检测方法。结果通过收集和筛选资料,共有126例病例符合本研究所规定的条件,对所有研究对象进行调查和采集临床标本,共采集咽拭液标本126份。经过组织培养共有58份标本出现CPE,其中5份为典型细胞融合病变,53份为其他细胞病变。经过real-time PCR方法鉴定出12份为呼吸道合胞病毒,经过Ag-ELISA鉴定出8份呼吸道合胞病毒,通过针对黏附蛋白G蛋白基因的引物的RT-PCR反应,共有6份标本扩增出了阳性条带,对这6份病毒标本的RT-PCR扩增产物进行了核苷酸序列测定,获得这些病毒的G蛋白基因全长核苷酸序列,分别编号为henan2006/A36、henan2006/A39、henan2006/207、henan2006/305、henan2006/417、henan2006/589,其核苷酸序列长度均为922bp。将所得到的核苷酸序列导入DNASTAR软件MegAlign模块中,进行核苷酸序列同源性分析,通过分离毒株序列两两比较,其同源性最大99%,最小88%,将所测核苷酸序列推导出氨基酸序列进行同源性比较,同源性在90%～95%之间,其与RSVA型毒株序列同源性为87%～94%,与RSVB型毒株序列同源性33%～35%。从Pubmed基因数据库中查找并下载多条RSV毒株G蛋白基因核苷酸参考序列,与样本序列导入DNASTAR软件MegAlign模块中进行比较,并构建系统进化树,确定病毒型别。通过比较不同的RSV鉴定方法,实验结果表明,共检测12株呼吸道合胞病毒,其中组织培养分离出5株病毒,real-time PCR检出12株病毒,Ag-ELISA检出8株病毒,对上述数据进行统计学处理,检出率经配对卡方检验,real-time PCR和Ag-ELISA两种方法差异无统计学意义（P＞0.10,χ2=2.25）,检测敏感性没有显著性差异,都可以用来进行快速检测。结论1.通过检测结果的比较,real-time PCR实验与Ag-ELISA实验对于呼吸道合胞病毒的检测,检测敏感性差异无统计学意义。2.在我省部分地区2006～2007年度婴幼儿急性呼吸道感染病例中,RSV感染毒株以A型毒株为主。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文部分 河南省呼吸道合胞病毒分子生物学研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述部分
• 呼吸道合胞病毒的分子生物学特征及疫苗研究
• 参考文献
• 附录
• 英文缩略词表
• 硕士研究生期间发表的学术论文
• 后记