合作杨苗木群体诱导抗性形成相关信号物质的研究

论文摘要

本研究以造林中常见树种合作杨(P. Simoni×P. Pyramibalis c. v)为实验材料,采用不同处理方式——人为止血钳夹伤、扬扇舟蛾取食以及茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonic acid, MeJA)熏蒸处理合作杨,检测了受损伤及与损伤邻近健康植株体内酚类物质的含量、过氧化物酶(Perxoidase, POD)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)和脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)酶活性的变化。 结果发现机械损伤与昆虫取食后,合作杨损伤叶片内酚类物质含量及其合成代谢相关酶(PPO, POD)活性的变化有明显不同,说明植物可以识别不同的外界刺激,并启动不同的防御体系。与机械损伤相比,昆虫取食时口腔分泌物中的活性物质以及昆虫的连续损伤是造成该差异的主要原因。诱导叶片中酚类物质的变化说明,机械损伤与昆虫取食均能诱导植物释放具有信号功能的挥发物,将伤信号传递给健康植株引起酚类物质的变化降低可食性从而提高群体抗性。 用在草本植物中公认的信号分子——MeJA熏蒸健康合作杨植株,其体内的酚类及PPO及POD也发生了显著变化。表明MeJA可作为木本植物间的信号分子,传递损伤信号,诱导群体抗性的产生,使植物提前作出防御反应。MeJA熏蒸诱导产生的酚酸类物质含量与损伤诱导的变化有所差异,表明,株间信号组成并非单一组分。 茉莉酸(Jasmonic acid, JA)途径是植物体内重要的防御信号传递途径,介导了多种防御物质的合成,LOX是其合成途径中的关键酶。通过检测三种处理后合作杨叶片中LOX活性变化,发现LOX活性的升高,说明三种处理均启动了JA途径,从而诱导植物抗性产生。损伤及邻近健康植株中LOX活性变化表明,群体诱导抗性形成中,可能首先启动LOX基因,导致合成增加,LOX酶活性提高,加速了JA的形成,引发了一系列的抗性反应。 处理植株中抗性物质的合成及酶的变化,都是基因表达调控的结果。为了分离克隆机械损伤诱导的特异表达基因,本次试验运用抑制性扣除杂交技术,用损伤24小时后合作杨的cDNA与对照cDNA进行了杂交,杂交产物被转入top10中,出现杂交斑点,目前还未测序,此部分实验正在进行中。

论文目录

• 独创性声明
• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章：综述
• 1 抗性机制的研究
• 1.1 植物防御体系的激活
• 1.1.1 直接防御
• 1.1.2 间接防御
• 1.2 抗性反应的产生
• 1.2.1 系统获得性抗性
• 1.2.2 临近植株获得抗性
• 1.3 抗性信号的传递
• 1.3.1 系统性信号分子
• 1.3.1.1 茉莉酸
• 1.3.1.2 脱落酸
• 1.3.1.3 水杨酸
• 1.3.2 植株间抗性信号分子
• 1.3.2.1 虫害诱导植物产生的挥发性物质
• 1.3.2.2 机械损伤诱导产生的挥发物
• 1.3.3 挥发物的合成途径
• 1.3.4 挥发物的释放
• 1.4 植物抗性物质的生物合成途径
• 1.4.1 茉莉酸途径
• 1.4.1.1 脂氧合酶（LOX）
• 1.4.1.2 丙二烯氧化物合酶（AOS）
• 1.4.1.3 丙二烯氧化物环化酶（AOC）
• 1.4.2 水杨酸途径
• 1.4.3 苯丙氨酸途径
• 1.4.4 ABA信号途径
• 1.4.5 各途径之间的关系
• 1.4.5.1 SA与JA信号途交叉
• 1.4.5.2 ABA与JA途径的交叉
• 1.5 植物防御体系相关基因的表达
• 1.6 本研究的研究目的及思路
• 第二章：机械损伤及昆虫取食对酚类物质的影响
• 2.1 实验方法
• 2.1.1 植物材料与处理
• 2.1.1.1 机械损伤处理
• 2.1.1.2 扬扇舟蛾取食处理
• 2.1.2 样品处理与HPLC
• 2.2 结果与讨论
• 第三章：损伤对合作杨体内POD及PPO酶活性的影响
• 3.1 过氧化物酶、多酚氧化酶活性测定
• 3.1.1 实验方法
• 3.1.1.1 POD活性测定
• 3.1.1.2 PPO活性测定
• 3.1.2 实验结果及讨论
• 3.1.2.1 损伤对合作杨叶片内POD酶活性的影响
• 3.1.2.2 损伤对合作杨叶片内PPO酶活性的影响
• 第四章：JA信号合成途径中JA含量与脂氧合酶的活性检测
• 4.1 实验方法
• 4.1.1 JA含量的测定
• 4.1.2 LOX活性测定
• 4.2 实验结果及讨论
• 第五章：MEJA熏蒸对植物体内酚类物质含量及酶活性的影响
• 5.1 材料和方法
• 5.2 结果及讨论
• 5.2.1 MeJA熏蒸后合作杨体内酚类物质含量的变化
• 5.2.2 MeJA熏蒸合作杨叶片内PPO、POD、LOX活性变化
• 第六章：利用快速扣除杂交技术（RASH）克隆合作杨创伤诱导基因
• 6.1 材料
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 主要试剂
• 6.2 实验步骤及结果
• 6.2.1 合作杨总RNA的提取
• 6.2.2 用磁珠法分离total RNA中的mRNA
• 6.2.2.1 探针的退火
• 6.2.2.2 贮液准备（溶液冷却时，准备0.5×、0.5×SSC）
• 6.2.2.3 洗涤磁珠
• 6.2.2.4 寡核苷酸—RNA杂交体的捕获与清洗
• 6.2.3 双链cDNA的合成
• 6.2.3.1 eDNA第一链的合成
• 6.2.3.2 cDNA第二链的合成
• 6.2.3.3 补平
• 6.2.4 从磁珠上切下cDNA片段
• 6.2.5 cDNA与衔接子连接
• 6.2.6 RaSH—快速扣除杂交
• 6.2.6.1 cDNA片段的DpnⅡ酶切（tester与driver同时进行）
• 6.2.6.2 酶切产物纯化
• 6.2.6.3 酶切产物补平
• 6.2.6.4 接头连接
• 6.2.6.5 Driver PCR扩增
• 6.2.6.6 tester 用Xho Ⅰ酶切
• 6.2.6.7 经酶切的Tester cDNA与Driver cDNA杂交
• 6.2.7 载体构建
• 6.2.7.1 PSP72的转化（以下均为无菌操作）
• 6.2.7.2 质粒提取
• 6.2.7.3 用Xho 1酶切载体
• 6.2.7.4 酶切产物回收
• 6.2.8 扣除cDNA的克隆
• 6.2.8.1 转化
• 6.2.8.2 PCR结果显示有微弱的信号
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 合作杨总RNA的提取
• +）mRNA的分离'>6.3.2 合作杨Poly（A⁺）mRNA的分离
• 6.3.3 cDNA双链的合成
• 6.3.4 快速扣除杂交
• 6.3.4.1 结果
• 第七章：结论
• 7.1 结论与讨论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 致谢