来源于枯草芽孢杆菌碱性果胶酶基因工程菌的构建与发酵优化

来源于枯草芽孢杆菌碱性果胶酶基因工程菌的构建与发酵优化

论文摘要

碱性果胶酶(E.C.4.2.2.2,简称PGL),在碱性环境下具有高活性,可以利用反式消去作用切断聚乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键,同时释放出△4:5不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶可应用于纺织精炼,去除棉纤维初生胞壁中的果胶质或作为煮练助剂。以该酶为主的生物酶精炼工艺更替传统的化学工艺,可以降低热能与化学品的消耗、减缓环境污染,而且被处理织物的柔软性与染色均匀性均优于传统工艺。为了克服毕赤酵母工程菌发酵周期长、工艺流程复杂、低温诱导能耗高等问题,将碱性果胶酶基因在大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等原核体系中中过量表达被认为是最有效的途径之一。本论文将来源于枯草芽胞杆菌Bacillus sp. WSHB04-02的PGL基因表达于大肠杆菌中,同时在枯草芽孢杆菌体系中进行尝试。以E. coli BL21(DE3)为出发菌株,以高产量、高分泌能力和高生产强度为目标,通过详尽分析培养条件与诱导条件对重组大肠杆菌高效表达的影响,得出摇瓶分泌表达PGL的最佳条件;通过分阶段流加甘油和根据菌体发酵生长特性设计诱导策略,以控制副产物乙酸积累,实现了重组大肠杆菌PGL的胞外过量生产。本论文的主要研究内容包括:(1)将来源于Bacillus sp. WSHB 04-02的PGL基因插入质粒pET-20b(+)的pel B信号肽序列下游,最终表达于宿主菌E. coli BL21(DE3)中。(2)为提高重组E. coli BL21(DE3)的生产强度与分泌强度,在摇瓶中优化了影响重组大肠杆菌生产PGL的关键因素,确定了其胞外表达的最适条件。发酵培养基为:安琪酵母粉24 g L-1、蛋白胨11 g L-1、甘油10 g L-1、K2HPO4 72 mmol L-1、KH2PO4 17 mmol L-1。于OD600=0.6时添加0.05 mmol L-1 IPTG诱导表达48 h,诱导温度为26 oC。发酵结束时菌体干重为11.8 g L-1,PGL胞外酶活达127.4 U mL-1,较初始条件所产的胞外酶活提高约14倍。同时发现,菌体生长初期添加520 mmol L-1 Ca2+对PGL的可溶表达具有促进作用。(3)实验发现,在指数流加过程中,添加IPTG诱导后甘油残留和乙酸积累严重。为减缓这一问题,采用甘油两阶段流加策略:诱导前(菌体生长阶段),控制温度为37 oC,待甘油耗尽,以指数方式流加甘油(μset=0.2),以通气量和搅拌转速控制DO为30%;诱导时(PGL高表达阶段),加入0.05 mmol L-1 IPTG,降温至26 oC,以12 mL h-1的速率进行甘油流加,维持DO为30%。(4)为了进一步缓解诱导重组酶对菌体造成的代谢压力,提升PGL可溶表达水平,考察了诱导时机对重组大肠杆菌胞外生产PGL的影响。实验表明,在中密度诱导时PGL合成水平最高,胞外酶活与胞内酶活分别为257.8 U mL-1和114.1 U mL-1。通过流加与诱导策略的优化,发酵结束时PGL总酶活达371.9 U mL-1,生产强度为7.1 U mL-1 h-1,实现了PGL的高产量与高生产强度生产,是已报道大肠杆菌表达PGL的最高水平。(5)将来源于Bacillus sp. WSHB 04-02的PGL基因分别克隆到pMA09.11、pP43NMK与pHT43大肠杆菌-枯草穿梭质粒中,并转化相应宿主,得到B. subtilis WB600/pMA/pgl(sp)、B. subtilis WB600/pP43NMK/pgl(sp)、B. subtilis WB600/pP43NMK/pgl、B. subtilis 168/pHT43/pgl和B. subtilis 168/pHT43/pgl(BA)五株重组菌,其中B. subtilis WB600/pMA/pgl(sp)所表达重组PGL胞外酶活为28.7 U mL-1,另外四株重组菌PGL酶活均低于3.0 U mL-1。(6) E. coli BL21 (DE3)(pET-20b(+)/pgl)与B. subtilis WB600/pMA/pgl(sp)所产PGL的适宜温度范围为分别为5060 oC与5065 oC,在3555 oC之间具有良好的热稳定性,酶活力保持在90%以上,满足棉织物精炼的要求(温度范围4060 oC)。两株重组菌所产PGL适宜pH范围分别为8.610.6、9.010.0,同样符合棉织物精炼的要求(最适pH 910)。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 目录
  • 第一章 绪论
  • 1.1 背景
  • 1.2 碱性果胶酶概述
  • 1.3 大肠杆菌表达体系简介
  • 1.3.1 异源蛋白在大肠杆菌中的分泌表达
  • 1.3.2 流加策略在重组大肠杆菌中的应用
  • 1.4 枯草芽孢杆菌表达系统简介
  • 1.4.1 枯草芽孢杆菌表达系统的主要优点
  • 1.4.2 枯草芽孢杆菌表达系统常用载体
  • 1.5 立题依据
  • 1.5.1 碱性果胶酶在棉织物前处理中的应用
  • 1.5.2 碱性果胶酶异源表达研究现状
  • 1.6 本论文主要研究内容
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 菌株与质粒
  • 2.1.2 主要试剂和仪器
  • 2.1.3 培养基
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 DNA 操作
  • 2.2.2 碱性果胶酶基因的克隆
  • 2.2.3 大肠杆菌表达载体pET-20b(+)/pgl 的构建与转化
  • 2.2.4 枯草芽孢杆菌表达载体的构建与转化
  • 2.2.5 培养方法
  • 2.2.6 菌体浓度测定
  • 2.2.7 重组PGL 的定位
  • 2.2.8 SDS-PAGE 分析
  • 2.2.9 碱性果胶酶酶活力的测定
  • 2.2.10 甘油与乙酸浓度的测定
  • 2.2.11 重组酶酶学性质初步分析
  • 第三章 结果与讨论
  • 3.1 枯草芽孢杆菌PGL 基因在大肠杆菌中的克隆与表达
  • 3.1.1 PGL 结构基因的核苷酸序列及对应氨基酸序列分析
  • 3.1.2 PGL 基因在大肠杆菌中的表达
  • 3.2 影响重组大肠杆菌胞外生产PGL 关键因素的探索
  • 3.2.1 培养基组分对重组PGL 胞外生产的影响
  • 3.2.2 金属离子及其浓度对PGL 胞外生产的影响
  • 3.2.3 诱导温度对重组PGL 胞外生产的影响
  • 3.2.4 诱导剂浓度对重组PGL 胞外生产的影响
  • 3.3 采用流加策略发酵生产PGL
  • 3.3.1 两阶段甘油流加策略对重组大肠杆菌胞外生产PGL 的影响
  • 3.3.2 流加培养过程诱导时机的研究
  • 3.4 PGL 基因在枯草芽孢杆菌中的表达
  • 3.5 重组碱性果胶酶粗酶性质的初步研究
  • 3.5.1 重组菌产PGL 的适宜温度范围及温度稳定性
  • 3.5.2 重组菌产PGL 的适宜pH
  • 主要结论与展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文
  • 相关论文文献

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