论文摘要
碱性果胶酶（E.C.4.2.2.2,简称PGL）,在碱性环境下具有高活性,可以利用反式消去作用切断聚乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键,同时释放出△4:5不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶可应用于纺织精炼,去除棉纤维初生胞壁中的果胶质或作为煮练助剂。以该酶为主的生物酶精炼工艺更替传统的化学工艺,可以降低热能与化学品的消耗、减缓环境污染,而且被处理织物的柔软性与染色均匀性均优于传统工艺。为了克服毕赤酵母工程菌发酵周期长、工艺流程复杂、低温诱导能耗高等问题,将碱性果胶酶基因在大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等原核体系中中过量表达被认为是最有效的途径之一。本论文将来源于枯草芽胞杆菌Bacillus sp. WSHB04-02的PGL基因表达于大肠杆菌中,同时在枯草芽孢杆菌体系中进行尝试。以E. coli BL21（DE3）为出发菌株,以高产量、高分泌能力和高生产强度为目标,通过详尽分析培养条件与诱导条件对重组大肠杆菌高效表达的影响,得出摇瓶分泌表达PGL的最佳条件;通过分阶段流加甘油和根据菌体发酵生长特性设计诱导策略,以控制副产物乙酸积累,实现了重组大肠杆菌PGL的胞外过量生产。本论文的主要研究内容包括:（1）将来源于Bacillus sp. WSHB 04-02的PGL基因插入质粒pET-20b（+）的pel B信号肽序列下游,最终表达于宿主菌E. coli BL21（DE3）中。（2）为提高重组E. coli BL21（DE3）的生产强度与分泌强度,在摇瓶中优化了影响重组大肠杆菌生产PGL的关键因素,确定了其胞外表达的最适条件。发酵培养基为:安琪酵母粉24 g L-1、蛋白胨11 g L-1、甘油10 g L-1、K2HPO4 72 mmol L-1、KH2PO4 17 mmol L-1。于OD600=0.6时添加0.05 mmol L-1 IPTG诱导表达48 h,诱导温度为26 oC。发酵结束时菌体干重为11.8 g L-1,PGL胞外酶活达127.4 U mL-1,较初始条件所产的胞外酶活提高约14倍。同时发现,菌体生长初期添加520 mmol L-1 Ca2+对PGL的可溶表达具有促进作用。（3）实验发现,在指数流加过程中,添加IPTG诱导后甘油残留和乙酸积累严重。为减缓这一问题,采用甘油两阶段流加策略:诱导前（菌体生长阶段）,控制温度为37 oC,待甘油耗尽,以指数方式流加甘油（μset=0.2）,以通气量和搅拌转速控制DO为30%;诱导时（PGL高表达阶段）,加入0.05 mmol L-1 IPTG,降温至26 oC,以12 mL h-1的速率进行甘油流加,维持DO为30%。（4）为了进一步缓解诱导重组酶对菌体造成的代谢压力,提升PGL可溶表达水平,考察了诱导时机对重组大肠杆菌胞外生产PGL的影响。实验表明,在中密度诱导时PGL合成水平最高,胞外酶活与胞内酶活分别为257.8 U mL-1和114.1 U mL-1。通过流加与诱导策略的优化,发酵结束时PGL总酶活达371.9 U mL-1,生产强度为7.1 U mL-1 h-1,实现了PGL的高产量与高生产强度生产,是已报道大肠杆菌表达PGL的最高水平。（5）将来源于Bacillus sp. WSHB 04-02的PGL基因分别克隆到pMA09.11、pP43NMK与pHT43大肠杆菌-枯草穿梭质粒中,并转化相应宿主,得到B. subtilis WB600/pMA/pgl（sp）、B. subtilis WB600/pP43NMK/pgl（sp）、B. subtilis WB600/pP43NMK/pgl、B. subtilis 168/pHT43/pgl和B. subtilis 168/pHT43/pgl（BA）五株重组菌,其中B. subtilis WB600/pMA/pgl（sp）所表达重组PGL胞外酶活为28.7 U mL-1,另外四株重组菌PGL酶活均低于3.0 U mL-1。（6） E. coli BL21 （DE3）（pET-20b（+）/pgl）与B. subtilis WB600/pMA/pgl（sp）所产PGL的适宜温度范围为分别为5060 oC与5065 oC,在3555 oC之间具有良好的热稳定性,酶活力保持在90%以上,满足棉织物精炼的要求（温度范围4060 oC）。两株重组菌所产PGL适宜pH范围分别为8.610.6、9.010.0,同样符合棉织物精炼的要求（最适pH 910）。