山羊痘病毒基因缺失重组毒株的构建与生物学特性鉴定

论文摘要

山羊痘是一种急热性传染病,由山羊痘病毒（goatpox virus, GTPV）引发,临床上以出现发热和全身起痘为典型特征,具有很高的发病率和死亡率。我国目前使用山羊痘弱毒疫苗AV41株来预防山羊痘,但其在我国部分省份尤其是南方部分地区的羊痘防疫过程中,发现存在有安全隐患,可产生诸多不良反应,如全身发痘、孕羊流产等。因此,有必要进一步研制更为安全有效的新型基因工程疫苗。本研究利用分子生物学、病毒学和免疫学等方面的技术和手段,以GTPV弱毒疫苗毒株AV41为模板,分别设计4对引物,PCR扩增ORF5～ORF19和ORF149～ORF15两个区域两侧共四个基因组片段,分别作为同源重组左侧臂和右侧臂；运用分子技术,分别将两侧重组臂相连,并在两个重组臂中间插入报告基因EGFP和筛选基因gpt的表达盒,构建转移载体质粒pLF-Eg和pRF-Eg；分别将转移载体质粒pLF-Eg和pRF-Eg与GTPV AV41株共转染非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）,使其在细胞内发生同源重组,加压筛选并纯化重组GTPV；最后鉴定重组GTPV和检测其生物学特性。通过一系列实验研究,确定了GTPV基因组中的两个病毒复制非必需区,分别成功构建了敲除掉GTPV毒力相关基因ORF5～ORF19之间共15个ORF和ORF149～ORF151之间共3个ORF的两株重组山羊痘弱毒株。同时证实这两个基因重组缺失毒株均可稳定遗传,并保持了亲本毒株在细胞培养物中的生长特性。这为研制更安全、高效的山羊痘基因工程弱毒疫苗奠定基础,并为开发羊痘活载体疫苗提供了理想的载体。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 目录
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 GTPV的流行概况
• 1.2 病原学
• 1.2.1 病毒的分类及形态
• 1.2.2 病毒的理化特性
• 1.2.3 基因组结构
• 1.3 GTPV的诊断方法
• 1.3.1 临床诊断
• 1.3.2 实验室诊断
• 1.4 GTPV缺失重组病毒的构建与筛选
• 1.4.1 转移载体的构建元件
• 1.4.2 缺失重组病毒的构建
• 1.4.3 缺失重组毒的筛选
• 1.5 羊痘疫苗的研究概况
• 1.5.1 灭活疫苗
• 1.5.2 弱毒疫苗
• 1.5.3 亚单位疫苗
• 1.5.4 活载体疫苗和基因缺失疫苗
• 1.6 本研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒载体
• 2.1.2 病毒与细胞
• 2.1.3 主要试剂及其配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 引物设计
• 2.2 方法
• 2.2.1 原代犊牛睾丸（bovine testicle,BT）细胞的制备
• 2.2.2 GTPV的增殖
• 2.2.3 病毒DNA的提取
• 2.2.4 同源重组臂的克隆与鉴定
• 2.2.5 转移载体质粒pLF-Eg和pRF-Eg的构建及鉴定
• 2.2.6 重组病毒vLF-Eg和vRF-Eg的制备、纯化和鉴定
• 2.2.7 重组病毒的生物学特性鉴定
• 第三章 实验结果
• 3.1 同源重组臂基因片段的克隆和序列分析结果
• 3.1.1 同源重组基因片段的克隆结果
• 3.1.2 扩增片段的核苷酸同源性分析结果
• 3.2 中间转移载体PLF和PRF的鉴定结果
• 3.3 重组转移载体质粒的构建鉴定结果
• 3.4 重组病毒vLF-EG和vRF-EG的制备、纯化及PCR鉴定结果
• 3.5 重组病毒的生物学特性鉴定
• 50比较结果'>3.5.1 重组病毒与亲本病毒的TCID₅₀比较结果
• 3.5.2 重组病毒在BT细胞上的生长动力学
• 3.5.3 重组病毒的遗传稳定性
• 第四章 讨论
• 4.1 GTPV基因工程减毒疫苗的研究
• 4.2 GTPV ORF5～ORF19和ORF149～ORF151区域的分子背景分析
• 4.3 培养细胞的选择
• 4.4 基因缺失重组毒株的鉴定
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况