论文摘要
随着人们生活习惯、饮食结构的改变,糖尿病（Diabetes mellitus, DM）的发病率在全球迅速上升。糖尿病肾病（Diabetic nephropathy, DN）是DM患者最常见、最严重的全身性微血管并发症之一。目前,DN的发病机制尚不清楚,亦缺乏有效地治疗手段。因此,有效地治疗和预防DN成为临床医学领域中重要的问题。DN的发生一般认为是多种原因综合作用的结果,近年来研究揭示DN的发病在代谢紊乱与血流动力学改变的基础上,炎症机制是其持续发展的关键因素之一,其中炎症性细胞因子核因子-κB（Nuclear factor-kappa B, NF-κB）及单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）起重要的介导作用。NF-κB是一种重要的核转录因子,通常以无活性的形式存在于细胞质中,当在DM状态下受到感染、应激、细胞因子、氧自由基、糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗等因素刺激可致其活化,活化的NF-κB可诱导许多因子的转录,包括细胞因子如肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-a, TNF-a）;白介素系统；炎症细胞趋化因子如MCP-1等。高表达的炎症因子又进一步刺激NF-κB活化,形成炎症信号的正反馈,导致肾功能和组织学异常,促进DN的进展。受NF-κB调节的基因可参与肾脏病的进展,其中,MCP-1作用最为重要,MCP-1是一种特异的炎症细胞趋化因子,它能够促使单核细胞由外周循环迁移到炎症部位聚集并激活,通过多种机制损伤肾脏组织,对DN的发生、发展起关键作用。因此,对DN时NF-κB和由其诱导的炎症细胞趋化因子MCP-1表达的研究,必将有助于我们对DN发病机制的理解,为探索新的治疗途径和开发临床新药提供理论依据。目前西医治疗DN主要是控制高血糖、减少蛋白尿、控制高血压、低蛋白饮食及纠正脂代谢紊乱、抗炎等对症治疗,至今尚没有一个能完全阻断DN进展的药物。因此,依据传统中医理论和发挥中医药治疗DN的优势和特色,积极探求中医药治疗DN的有效方法,对防止或延缓其发展具有重要的意义。肾康丸作为医院制剂,在临床治疗DN患者多年,疗效确切,在一定程度上可延缓DN的进展,但其治疗DN的分子水平的机制尚不清楚。因此,本课题通过体内、体外实验,从NF-κB及MCP-1的表达出发,探讨肾康丸治疗DN的分子基因水平的作用机制,为其临床应用提供理论及实验依据。具体如下：第一部分肾康丸对DN大鼠的肾脏保护作用目的：探讨肾康丸对DN大鼠模型的肾脏保护作用,为进一步研究药物作用机制提供实验依据。方法：首先用链脲佐菌素（Streptozotocill, STZ）按55mg·kg-1大鼠体重左下腹腔内一次性注射制作DM大鼠模型。连续喂养2w（Week,w）,测血糖、尿量、尿蛋白,若血糖值>16.6mmol·L-1、尿量>原尿量150%、尿蛋白排泄>30mg·kg·/24h以上,则造模成功。大鼠造模成功后,称重,随机分3组：模型对照组,美卡素组和肾康丸组,另设正常对照组。肾康丸组大鼠实验用量设定为1.1g·kg-1大鼠体重,肾康丸研磨后用蒸馏水配成0.22g·mL-1混悬液。美卡素片组大鼠实验用量设定为7.2mg·kg-1大鼠体重,美卡素片研磨后用蒸馏水配成2.9mg·mL-1溶液。模型对照和正常对照组大鼠灌服等容积生理盐水。每日1次,连续8w。各组大鼠自由进食饮水,实验中不予任何降血糖药物。治疗期间及治疗后观察大鼠一般状况、血糖、尿糖。末次给药后计24h尿量和饮水量,然后用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,腹主动脉穿刺采血,分离血清,全自动生化分析仪检测大鼠血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、血总胆固醇（TC）、血甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）；用紫外分光光度法检测糖化血红蛋白（GHb）；考马斯亮兰法检测24h尿蛋白（Upro）；取大鼠肾脏,观察肾脏大小,计算肾重、相对肾重,并通过HE染色法观察大鼠肾脏组织病理变化。结果：1.46只大鼠用于造模,成模率78.9%（30/38）,成模后病死率4.67%（2/30）。2.8周治疗期间,模型组大鼠血糖均维持在16.7mmol·L-1以上,尿糖+++以上,表现出多饮、多食、多尿、消瘦的DM症状,肾康丸、美卡素治疗组大鼠一般情况均较模型对照有所改善。3.正常对照组及各治疗组大鼠体重均较治疗前增加（均P<0.05）,与模型对照组相比较,肾康丸组与美卡素组增长量显著增加（均P<0.05）。4.与正常对照组比较,各组大鼠血糖、GHb、24hUpro、Scr、BUN、TC、TG、LDL-c均显著升高（均P<0.05）,24h尿量及饮水量增加（均P<0.05）；与模型对照组比较,肾康丸、美卡素治疗均可以降低24hUpro、BUN、Scr及24h尿量及饮水量（均P<0.05）；肾康丸治疗可以降低血糖、GHb（均P<0.05）；各组中,仅肾康丸组TC、TG、LDL-c显著下降（均P<0.05）。5.与正常对照组比较,各组大鼠HDL-c显著降低（均P<0.05）。与模型对照组相比,仅肾康丸治疗组对HDL-c具有显著升高作用（P<0.05）6.与正常对照组比较,模型组大鼠肾重及相对肾重增加（P<0.05）,且出现了相当于Mogensen分期的3期左右DN病理损害；肾康丸、美卡素治疗均可以降低模型大鼠肾重及相对肾重（均P<0.05）。肾康丸、美卡素组病理改变较模型组均有不同程度的减轻,其中肾康丸组效果更为显著。结论：1.肾康丸能够改善实验性DN大鼠一般状态,具有一定的调节血糖、血脂代谢的作用。2.肾康丸能够降低实验性DN大鼠尿蛋白,降低血清BUN及Scr水平,具有一定的保护肾功能作用。3.肾康丸能够改善DN大鼠肾脏组织病理学改变,缓解肾脏病理损伤。第二部分肾康丸对DN大鼠肾脏NF-κB及MCP-1表达的影响目的：探讨肾康丸对DN大鼠肾脏NF-κB及MCP-1表达的影响。方法：取第一部分各组大鼠左肾组织,沿正中矢状面剖开,用PBS冲洗干净,除去包膜,投入10%甲醛中性缓冲液中固定,应用SP（过氧化物酶标记的链霉卵白素Streptavidin/Peroxidase）法进行免疫组织化学染色,一抗分别为兔抗大鼠NF-κB、MCP-1、多克隆抗体。检测肾脏组织NF-κB及MCP-1蛋白的表达。取20mg左右-70℃冻存肾组织,PBS冲洗干净,冰浴中快速匀浆,按试剂盒说明书提取总RNA。逆转录反应依照Promega公司提供的逆转录系统试剂盒说明书进行。取1.5μg总RNA采用M-MLV转录成cDNA,采用SYBR Premix Ex TaqTM在FTC-2000型实时荧光定量PCR （RT-PCR）仪上进行荧光定量PCR,内参照采用GAPDH,检测肾脏组织NF-κB及MCP-1mRNA表达。结果：1.NF-κB、MCP-1在正常组肾组织内极少量表达；与正常组大鼠相比,模型组NF-κB、MCP-1在肾小球内、肾间质、肾小管表达量增加；与模型组比较,肾康丸组、美卡素组NF-κB、MCP-1在肾小球、肾间质、肾小管表达量降低,其中肾康丸组效果明显。2.与正常组比较,模型组大鼠肾脏NF-κB、MCP-1mRNA表达量增加；与模型组比较,肾康丸组、美卡素组大鼠肾脏NF-κB、MCP-1mRNA的表达量降低。结论：1.肾康丸可以下调DN大鼠肾脏组织NF-κBmRNA及蛋白表达。2.肾康丸可以下调DN大鼠肾脏组织MCP-1mRNA及蛋白表达。第三部分肾康丸对高糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞NF-κB及MCP-1表达的影响目的：探讨肾康丸对高糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞（Mesangial cell, MC）NF-κB及MCP-1表达的影响。方法：1.药物血清制备：16只大鼠随机分为4组,通过给予大鼠分别灌服肾康丸、美卡素和生理盐水7天后,分离药物血清,制备肾康丸高、低剂量含药血清、阳性对照美卡素含药血清和空白血清。2.MC培养分组：购自武汉大学,取第4-8代细胞随机分为6组：正常葡萄糖组、高糖刺激组、高糖刺激加正常血清组、美卡素含药血清组、肾康丸高剂量组、肾康丸低剂量组,每组6孔,以相应的试剂及药物血清干预24小时后,吸取上清,提取核蛋白,并提取细胞总RNA。3.酶联免疫吸附法（ELISA）法检测细胞核蛋白NF-κB及细胞培养上清液中MCP-1的浓度。4.RT-PCR法检测细胞中NF-κBmRNA和MCP-1mRNA表达：Trizol法提取和纯化MC总RNA,以0.1%DEPC处理水50μl溶解后分装,加RNAin保存于-70℃冰箱。设计NF-κB、MCP-1及内参GAPDH引物序列,取总RNA5μl进行逆转录,逆转录反应依照Promega公司提供的逆转录系统试剂盒说明书进行。采用SYBR Premix Ex TaqTM在FTC-2000型实时荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR,内参照采用GAPDH,检测MC中NF-K B及MCP-1mRNA表达。结果：1.与正常葡萄糖组比较,高糖组MC细胞核蛋白提取物中NF-K B表达增加,有统计学意义（P<0.05）；与高糖组比较,肾康丸高、低剂量组及美卡素组MC核蛋白提取物中NF-K B含量减少,有统计学意义（均P<0.05）；正常大鼠血清组与高糖组比较,MC核蛋白提取物中NF-K B的含量变化无统计学意义（P>0.05）。2.与正常葡萄糖组比较,高糖组MC上清液中MCP-1表达增加,有统计学意义（P<0.05）；与高糖组比较,肾康丸高、低剂量组及美卡素组MC上清液中MCP-1含量减少,有统计学意义（均P<0.05）,其中肾康丸高剂量组作用明显；正常大鼠血清组与高糖组比较,MC上清液中MCP-1的含量变化无统计学意义（P>0.05）。3.与正常葡萄糖组比较,高糖组MC中NF-κB、MCP-1mRNA表达增加,肾康丸含药血清、美卡素含药血清组可降低NF-κB、MCP-1mRNA的表达,其中以肾康丸高剂量含药血清组效果明显。结论：1.肾康丸可以下调高糖刺激的MC中升高NF-κBmRNA及蛋白表达。2.肾康丸可以下调高糖刺激的MC中升高MCP-1mRNA及蛋白表达。全文结论：本研究通过DN动物模型实验研究,再次证明肾康丸具有治疗DN和保护肾脏的作用；通过观察肾康丸对DN大鼠肾脏及体外高糖培养的MC细胞中NF-K B和MCP-1的表达情况,提示其可抑制NF-K B的活化,并可抑制炎性因子MCP-1的表达,可能部分通过减轻由其介导的炎症反应延缓DN进展,为肾康丸治疗DN提供了分子水平的实验依据。
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