六味地黄丸联合bFGF诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

论文摘要

目的：通过细胞生物学技术,探讨分离、培养、纯化和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）的方法,观察滋补肝肾中药六味地黄丸联合碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）体外诱导大鼠BMSCs分化为神经元样细胞的作用,探索获得较高比例神经元样细胞的诱导方法。方法：采用全骨髓贴壁分离法分离、培养SD大鼠BMSCs,以纯化的BMSCs为研究对象,观察细胞形态变化、生长增殖状态,MTT法检测绘制细胞生长曲线,对第3代细胞进行表面标志物CD44、CD34免疫细胞化学染色法检测,鉴定BMSCs。鉴定后,第3代细胞经bFGF预诱导24小时后按空白组、bFGF组、六味地黄丸组、bFGF+六味地黄丸组分别加入相应诱导液进行诱导,观察细胞形态变化；诱导培养7天,采用免疫细胞化学染色法检测相关标志物巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：1.采用全骨髓贴壁分离法获得原代BMSCs,随多次换液弃悬浮细胞传代弃其它贴壁细胞后得到纯化的BMSCs.经分离培养的第3代细胞增殖旺盛,具有较好的活力,利于诱导进行。免疫细胞化学染色结果显示CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达。2.生长良好的第3代BMSCs经bFGF预诱导24小时后与空白组相比,细胞数量增多,立体感增强；各组BMSCs分别以不同诱导液进行诱导,2-3天细胞胞体收缩,形成圆形、不规整的锥形或三角形；4-5天,部分细胞逐渐伸出突起,多为2-3极,呈现较典型的神经元样细胞形态；6-7天,神经元样细胞数量增多,bFGF+六味地黄丸组更为明显。空白组细胞形态1-3天未出现明显改变,但生长速度明显减慢,其后出现老化、死亡脱落。3. bFGF组、六味地黄丸组和bFGF+六味地黄丸组均有Nestin、NSE、GFAP阳性表达,bFGF+六味地黄丸组各指标阳性率高于bFGF组、六味地黄丸组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1.经全骨髓贴壁分离法分离、培养的骨髓间充质干细胞能逐渐纯化,细胞活性较高、生物学性状稳定,适于做进一步研究。2.六味地黄丸能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,六味地黄丸和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导可获得较高比例的神经元样细胞。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词表
• 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 实验结果
• 2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养
• 2.2 骨髓间充质干细胞的传代扩增
• 2.3 贴壁率
• 2.4 生长曲线
• 2.5 细胞活力
• 2.6 骨髓间充质干细胞的鉴定
• 3 讨论
• 3.1 骨髓间充质干细胞的发现和命名
• 3.2 骨髓间充质干细胞的培养与鉴定
• 4 结论
• 第二部分 六味地黄丸联合bFGF诱导骨髓间充质干细胞定向分化为神经元样细胞的研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养
• 2.2 诱导后细胞形态学变化
• 2.3 诱导后神经标志物检测
• 3. 讨论
• 3.1 骨髓间充质干细胞的可塑性
• 3.2 骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化及Nestin、NSE、GFAP的表达
• 3.3 六味地黄丸和碱性成纤维细胞生长因子的选择
• 3.4 诱导中是否添加血清和诱导时间
• 3.5 实验意义
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附件1：综述 中药对骨髓间充质干细胞多向分化影响的研究进展
• 参考文献
• 附件2：发表论文
• 附件4：图片