论文摘要
肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质（特别是胶原）过度沉积.它不是一个独立的疾病,而是许多慢性肝病共同的病理过程,包括酒精性、病毒性、遗传代谢性、自身免疫性等都能导致肝组织纤维化的形成。目前,大多数抗肝纤维化药物临床效果不显著,或者药物毒性太大,实际应用受到限制。JAK/STAT信号转导通路是细胞因子信号转导通路之一,参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等很多重要的生物学过程。有研究证实JAK/STAT信号转导通路与肝纤维化有极其密切的联系,但具体的分子机制尚不清楚。因此,本实验研究探讨JAK/STAT信号转导通路在肝纤维发病机制中的作用及中成药扶正化瘀方对JAK/STAT信号转导通路在肝纤维发生的影响。实验分为两部分,第一部分采用四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型,探讨肝纤维化造模过程及自发逆转过程中JAK/STAT信号转导通路的动态变化,以此阐明JAK/STAT信号转导通路在肝纤维化过程中的发病机制。第二部分采用四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型,给予扶正化瘀干预,阐明扶正化瘀对纤维化JAK/STAT信号转导通路的影响,为中药扶正化瘀的继续研发提供实验依据,为临床抗肝纤维化的治疗寻求更广的途径。第一部分JAK/STAT信号转导通路在自发逆转肝纤维化模型的动态变化目的:肝纤维化（hepatic fibrosis）是指在不同病因的作用下,造成肝细胞慢性损伤及某些非实质细胞激活,引起纤维增生和纤维分解的不平衡,造成纤维结缔组织的过度沉积从而形成肝纤维化,其发展的后果是形成不可逆转的肝硬化阶段。大量实验研究,肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）证实为致肝纤维化的主要细胞,也是各种诱导肝纤维化因素发生的共同中心环节,HSC大量合成ECM,其也为ECM的主要来源。因此,HSC激活与肝纤维化的发生、发展有着极其密切的联系,活化HSC已被看作抗肝纤维化治疗的主要靶点。目前,有研究表明JAK/STAT信号转导通路在肝纤维化过程密切相关,但其作用的分子机制尚不清楚。因此,我们建立CCl4诱导大鼠肝纤维化模型,探讨JAK/STAT信号转导通路在肝纤维化形成过程及自发逆转过程中JAK1及STAT3的动态变化,阐明JAK/STAT信号转导通路在肝纤维化形成过程及自发逆转中的分子机制,为抗肝纤维化药物的研发提供理论基础。方法:选取8周龄的健康雄性Wistar大鼠66只,体重180～200g,购于河北医科大学实验动物中心。经过适应性喂养一周后,随机分两组:对照组18只、肝纤维化自发逆转模型组（简称模型组）48只。对照组予生理盐水腹腔注射（0.2ml/100g）,每周2次,共8周;模型组予30%CCL4橄榄油腹腔注射（0.2ml/100g）,每周2次;至第8周肝纤维化模型形成,CCL4停止给药。开始造模后的第4、6、8、10、12周分别处死8只大鼠,对照组于第4、6、8、10、12周末随机取处死大鼠3只,于第14周处死对照及模型组剩余全部大鼠。留取大鼠血清检测肝功能ALT、AST;留取部分肝组织置于冻存管放于-80℃冰箱冻存用于检测羟脯氨酸及提取肝组织总RNA,逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测大鼠肝组织JAK1、STAT3mRNA表达;留取部分肝组织置于10%的中性福尔马林固定,石蜡包埋,苏木精-伊红（HE）染色及Masson染色观察肝组织病理学改变;应用免疫组织化学染色法观察肝组织JAK1、STAT3蛋白的表达;结果:1实验大鼠的健康状况:对照组大鼠的活动能力强,食欲旺盛,毛发光泽且整齐,精神营养状况好,每周体重的增加正常。模型组造模阶段大鼠随着腹腔注入CCL4时间的延长,食欲开始下降,且精神萎靡,营养状况差,毛发失去色泽,体重增长缓慢,个别易激惹。8周后停用CCL4进入模型组自发逆转阶段后,大鼠食欲有所增加,精神、营养状态较前好转,体重有所增加。2实验大鼠血清ALT、AST水平检测:模型组大鼠血清第4、6、8、10、12、14周末血清ALT水平分别为:72.38±4.25 U/L、143.67±8.97U/L、264.61±14.63U/L、182.41±10.57U/L、112.64±14.15U/L、50.27±2.05U/L,均高于对照组（16.69±2.04U/L）,且各时间点之间均有明显差异（P<0.05）;AST分别为:182.35±4.12U/L、323.53±11.50U/L、501.04±24.15U/L、401.22±21.35U/L、140.20±10.33U/L、94.00±11.21 U/L,均高于对照组（17.21±2.34U/L）,模型组逆转期大鼠血清ALT、AST水平明显低于造模期。（Table1）3实验大鼠肝组织中羟脯氨酸（HYP）水平测定:模型组大鼠肝组织第4、6、8、10、12、14周末HYP水平依次为:195.97±17.90、346.35±15.25、478.80±8.16、414.62±10.04、361.42±14.06、296.58±16.51,均高于对照组（104.57±14.72）,模型组逆转期大鼠肝组织羟脯氨酸（HYP）水平明显低于造模期。（Table2）4实验大鼠肝脏病理学变化:肉眼观察对照组大鼠肝组织呈红褐色,质地柔软,有光泽,边缘光滑。模型组中肝组织与周围组织粘连,呈暗红色,体积较正常肝组织小,边缘变钝,表面有质粒感。5实验大鼠肝组织JAK1与STAT3蛋白表达情况:JAK1免疫组化染色阳性细胞为胞浆内表达棕黄色颗粒;STAT3免疫组化染色阳性细胞为胞核内表达棕黄色颗粒。对照组肝组织中仅有少量阳性细胞分布。模型组随着造模时间的延长,肝组织中JAK1和STAT3阳性表达细胞逐渐增多;8周末停用四氯化碳后,随着肝细胞的自我修复,肝细胞炎性及纤维化程度降低,JAK1和STAT3阳性表达细胞逐渐减少。模型组第4、6、8、10、12、14周末JAK1、STAT3阳性光密度值分别为（0.55±0.02、1.23±0.15、2.73±0.17、2.12±0.11、1.69±0.18、1.20±0.12）、（0.82±0.03、1.53±0.11、2.89±0.13、2.20±0.14、1.73±0.13、1.24±0.03）均显著高于对照组（0.21±0.04）、（0.24±0.06）,P <0.05;模型组逆转期大鼠肝组织JAK1与STAT3蛋白表达明显低于造模期。6实验大鼠肝组织JAK1与STAT3 mRNA表达情况:模型组第4、6、8、10、12、14周末肝组织中JAK1和STAT3 mRNA表达量分别为（0.76±0.04、1.54±0.06、2.48±0.03、1.99±0.10、1.51±0.11、1.12±0.10）、（0.81±0.09、1.65±0.07、2.66±0.10、2.02±0.04、1.61±0.11、1.20±0.07）均显著高于对照组（0.52±0.03）、（0.56±0.02）,P <0.05;模型组逆转期大鼠肝组织JAK1与STAT3mRNA表达明显低于造模期。7实验大鼠肝组织JAK1、STAT3 mRNA表达与肝组织HYP水平相关关系:实验大鼠肝组织JAK1mRNA表达与肝组织HYP水平、STAT3 mRNA表达与肝组织HYP水平之间的关系符合直线回归关系r=0.986,r=0.994,P <0.05。（Fig30、Fig31）结论:1大鼠经四氯化碳腹腔注射8周可诱导具有典型肝纤维化特征的动物模型,消除四氯化碳致纤维化因素后,可以部分逆转动物模型肝组织的纤维化。2 JAK/STAT信号转导通路在肝纤维化动态进展过程中JAK1和STAT3蛋白及mRNA表达增多,JAK1和STAT3mRNA表达水平与HYP水平存在相关关系,参与肝纤维化形成过程。3 JAK/STAT信号转导通路在自发逆转肝纤维过程中JAK1和STAT3蛋白及mRNA表达明显下降,参与大鼠肝纤维化自发逆转过程,提示JAK/STAT信号转导通路在肝纤维发病机制中具有重要作用。第二部分扶正化瘀方对肝纤维化大鼠JAK/STAT信号转导通路的作用目的:各种因素造成肝细胞的炎症及慢性损伤,导致肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）激活,引起ECM的大量合成,造成纤维结缔组织的过度沉积从而形成肝纤维化。因此,HSC是合成ECM的主要来源,也是不同致病因素导致肝纤维化发生的共同中心环节,活化HSC已被看作抗肝纤维化治疗的主要靶点。目前,HSC激活的信号转导通路研究较多的有NF-κB通路、TGF-β/Smad通路、MAPK通路,而JAK/STAT信号转导通路被许多研究证实在HSC激活、肝纤维形成过程中具有重要作用。近来,中药在抗肝纤维化方面作用显著,日益受到人们的重视,中药具有多靶点、多途径的综合药理作用。扶正化瘀方是由丹参、虫草菌丝、桃仁、五味子等6味中药所组成和提取的临床抗肝纤维化治疗药物,它的中医理论基于“气阴两虚、血瘀阻络”的肝纤维化中医病机。本研究探讨扶正化瘀方对大鼠肝纤维JAK/STAT信号转导通路的作用效果及机制,为抗肝纤维化的药物提供新的理论依据及阐明机制。方法:选取8周龄的健康雄性Wistar大鼠57只,体重180～200g,购于河北医科大学实验动物中心。经过适应性喂养一周后,随机分三组:对照组9只、模型组24只、扶正化瘀胶囊干预组24只。对照组给予生理盐水腹腔注射（0.2ml/100g）,每周2次,共8周;模型组给予30%CCL4橄榄油腹腔注射（0.2ml/100g）,每周2次,共8周;扶正化瘀胶囊干预组从造模开始起按0.2ml/100g体重（含扶正化瘀胶囊生药0.046g/ml）给予扶正化瘀胶囊药液灌胃,每日1次,共8周。对照组于第4、6、8周末随机取处死大鼠3只,其余两组第4、6、8周末随机取处死大鼠8只。留取实验大鼠血清检测ALT、AST;留取部分肝组织置于冻存管放于-80℃冰箱冻存用于检测羟脯氨酸及提取肝组织总RNA,逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测大鼠肝组织JAK1、STAT3mRNA表达;留取部分肝组织置于10%的中性福尔马林固定,石蜡包埋,苏木精-伊红（HE）染色及Masson染色观察肝组织病理学改变;应用免疫组织化学染色法观察肝组织JAK1、STAT3蛋白的表达。结果:1实验大鼠一般情况:对照组大鼠精神、食欲良好,毛发整齐而有光泽,活拨好动,每周体重增加正常。模型组大鼠随着造模时间的延长,精神萎靡,食欲下降,体重增长缓慢,毛色转黄,失去光泽,个别变得易激惹,甚至个别出现腹腔积液。扶正化瘀方干预组精神、饮食可,毛色有光泽,较模型组症状轻。2扶正化瘀方对实验大鼠肝血清ALT、AST水平影响:模型组大鼠第4、6、8周末血清ALT水平分别为:72.38±4.25 U/L、143.67±8.97U/L、264.61±14.63U/L,均高于对照组（17.37±5.04 U/L）,且各时间点之间均有明显差异（P<0.05）;AST分别为:182.35±4.12U/L、323.53±11.50U/L、501.04±24.15U/L,亦均高于对照组（19.20±4.93 U/L）,且各时间点之间亦均有明显差异（P<0.05）。扶正化瘀方干预组大鼠第4、6、8周末ALT分别为:58.02±9.02 U/L、104.00±13.12 U/L、147.00±15.73U/L,均高于对照组（17.37±5.04 U/L）,且各时间点之间均有明显差异（P<0.05）;AST分别为:118.00±13.23U/L、228.49±13.01U/L、302.17±17.19 U/L,均高于对照组（19.20±4.93 U/L）,且各时间点之间亦均有明显差异（P<0.05）。相同时间点,与模型组相比,扶正化瘀方干预组ALT、AST水平均较低（P<0.05）。（Table1）3实验大鼠肝组织中HYP水平检测:模型组第4、6、8周末肝组织中HYP（195.97±17.90、346.35±15.25、478.80±8.16）及扶正化瘀方干预组HYP（ 132.67±11.24、246.36±13.16、444.67±13.24ug/g ）均高于对照组（114.26±18.72ug/g）,P <0.05;扶正化瘀方干预组HYP水平明显低于模型组。（Table2）4扶正化瘀方对实验大鼠肝组织病理学影响:肉眼观察:对照组肝脏颜色鲜红,有光泽,表面光滑,边缘锐利,与周围组织无粘连,质地软而脆,触之易碎。模型组4和6周末体积多无明显改变,部分稍有增大,呈浅黄色,表面有脂肪组织附着,易剥离,肝脏边缘变钝,质地较韧,不易碎,切面油腻;8周末体积多无明显改变,部分稍有减小,颜色暗红,表面有泥沙样结节,多与大网膜粘连,不易分离,肝脏边缘明显变钝,触之稍硬,不易碎。扶正化瘀方干预组肝脏外观好于模型组。HE及Masson胶原染色:对照组肝组织肝小叶结构正常,肝索排列整齐,无炎性坏死及纤维组织增生（Fig1,Fig8）。模型组4周时肝小叶结构紊乱,肝细胞出现水样变及脂肪变,可见炎症细胞浸润及纤维组织轻度的增生,汇管区扩大;干预组可见肝细胞轻度水样变及脂肪变,汇管区有少量炎症细胞浸润,轻微的纤维组织增生（Fig2,Fig3,Fig9,Fig10）。6周时肝细胞呈弥漫性脂肪变性,伴以单核细胞为主的混合性炎细胞浸润,部分肝小叶结构被破坏,纤维组织增生;干预组部分肝细胞脂肪变性,伴点、灶状坏死,纤维组织轻度增生,汇管区可见大量混合性炎细胞浸润（Fig4,Fig5,Fig11,Fig12）。8周模型组肝小叶结构大部分破坏,炎细胞浸润广泛浸润,纤维组织广泛增生,有假小叶形成;干预组部分肝小叶结构破坏,纤维组织增生,炎性细胞浸润,有假小叶形成,汇管区扩大,可见小胆管增生及炎细胞渗出（Fig6,Fig7,Fig13,Fig14）。5扶正化瘀方对实验大鼠肝组织JAK1和STAT3蛋白表达情况的影响:对照组肝组织中仅有少量阳性细胞分布。模型组随着造模时间的延长,肝组织中JAK1和STAT3阳性表达逐渐增多;干预组JAK1和STAT3阳性表达细胞较对照增加,但明显少于同时间段模型组。第4、6、8周末模型组JAK1和STAT3阳性光密度值（0.55±0.02、1.23±0.15、2.73±0.17）（0.82±0.03、1.53±0.11、2.89±0.13）及干预组JAK1和STAT3阳性光密度值（0.48±0.06、0.86±0.16、1.65±0.10）（0.57±0.04、1.12±0.12、1.90±0.08）均显著高于对照组（0.21±0.04）、（0.24±0.06）,P<0.05;扶正化瘀方干预组肝组织JAK1和STAT3蛋白表达明显低于模型组。（Fig22- Fig28）6扶正化瘀方对实验大鼠肝组织JAK1和STAT3 mRNA的动态表达的影响:模型组第4、6、8周末肝组织JAK1和STAT3 mRNA表达量分别为（0.76±0.04、1.54±0.06、2.48±0.03）、（0.81±0.09、1.65±0.07、2.66±0.10）,扶正化瘀干预组第4、6、8周末肝组织JAK1和STAT3 mRNA表达量分别为（0.52±0.06、0.96±0.12、1.52±0.14）、（0.62±0.02、1.05±0.10、1.64±0.11）均高于对照组（0.33±0.08）、（0.42±0.02）,P<0.05;且各组相同时间点之间均有明显差异（P<0.05）,扶正化瘀干预组肝组织JAK1和STAT3 mRNA的表达明显低于模型组。（Fig29）结论:1扶正化瘀可明显改善肝功能、炎症坏死及肝组织纤维程度,具有预防和治疗肝纤维化的作用。2扶正化瘀可明显抑制肝纤维化通路JAK1/STAT3mRNA及蛋白的表达,降低肝组织的炎症坏死,减轻肝纤维化的程度,阻止肝纤维化的进展,提示其在治疗肝纤维化中存在广阔的前景。