己烯雌酚的同源与异源ELISA检测方法的建立

论文摘要

“民以食为天,食以安为先”,食品安全是关系到人民健康和国计民生的重大问题。而其中的农兽药残留检测又是重中之重。本研究以己烯雌酚为靶标物,制备了己烯雌酚多克隆抗体并建立了针对己烯雌酚的同源异源ELISA检测方法。己烯雌酚是一种人工合成的雌性激素,同时也是一种环境内分泌干扰物,作为兽药广泛应用于水产品和禽畜的饲料添加剂,具有致癌性,并能引起婴幼儿和青少年的性早熟及男性女性化,容易在动物性食品中富集并在环境中降解缓慢,对人体健康和环境都造成了很大危害。本实验制备了三种己烯雌酚完全抗原,通过免疫家兔得到多克隆抗体,采用饱和硫酸铵分级沉淀法对其进行了纯化,得到了较高纯度的抗体。建立了针对己烯雌酚的同源与异源ELISA检测方法,相对于同源ELISA方法,异源ELISA方法提高了检测的灵敏度,降低了最低检出限。实验内容主要包括完全抗原的合成及鉴定、实验动物的免疫、多克隆抗体的制备与纯化、同源异源ELISA方法的建立及其精密度、特异性的测定、样品加标回收实验等。本实验室自行合成了三种羧基化己烯雌酚,这三种改造方式的相同之处是都在己烯雌酚的同一个位点改造,不同之处在于修饰上的连接臂的结构和长度不同,经1H核磁共振波谱（1建立了针对己烯雌酚的同源与异源ELISA分析方法。以DES-HS、CP-DES、HNMR）鉴定并确定改造成功后,利用EDC法将羧基化己烯雌酚与载体蛋白BSA、OVA进行了偶联,随后对获得的完全抗原进行了质谱及SDS-PAGE鉴定,结果显示完全抗原合成成功。实验动物的免疫采用完全抗原与等量弗氏佐剂（FA）混合,小剂量中程免疫的方法免疫2～2.5 Kg雌性家兔。首次免疫用完全抗原和等量弗氏完全佐剂混合乳化,颈背部皮下多点注射,之后的免疫用完全抗原与等量弗氏不完全佐剂混合乳化。每次免疫前耳缘静脉取血,间接ELISA法测定抗血清效价。待抗血清效价达到要求,进行间接竞争ELISA测定,结果显示抗血清对目标小分子具有竞争活性。随后进行加强免疫,并于五天后进行心脏动脉取血,静置取上清即为己烯雌酚多克隆抗体。采用盐析法对多克隆抗体进行提纯浓缩,经饱和硫酸铵分级沉淀分离得到5个梯度饱和度的沉淀重悬液。采用SDS-PAGE电泳法、蛋白印迹法（Western Blotting）、间接ELISA法对沉淀重悬液进行鉴定,结果显示20%～40%饱和度的沉淀重悬液含有针对己烯雌酚的抗体。将纯化后的抗体加入经高压灭菌的甘油（甘油终浓度为50%）,随后进行小管分装,-70℃保存。DES-MCME三种己烯雌酚的完全抗原为包被原,以针对DES-HS的抗体为共同抗体,对己烯雌酚进行同源异源ELISA检测,其中DES-HS完全抗原包被为同源分析,DES-CP和DES-MCME的完全抗原包被为异源分析。通过棋盘滴定法确定最适包被原浓度和最适抗体浓度。随后进行间接竞争ELISA检测,绘制竞争抑制曲线和抑制回归曲线,得到同源分析DES-HS的标准抑制曲线回归方程:I = 30.28 lgC + 23.25（R2 = 0.9768）,检测范围（IC80～IC20）为74.85～0.7810ng/mL,灵敏度IC50为7.646 ng/mL,最低检测限为0.3651 ng/mL;异源分析DES-CP、DES-MCME的标准抑制曲线回归方程分别为I = 22.75 lgC + 42.70（R2 = 0.9289）、I = 24.61 lgC + 36.77（R2=0.9289）,检测范围（IC80～IC20）分别为43.61～0.1005ng/mL、57.10～0.2082 ng/mL,灵敏度IC50分别为2.094 ng/mL、3.448 ng/mL,最低检测限（LOD）分别为0.03653 ng/mL、0.08170 ng/mL。在精密度实验中,不管是同源分析还是异源分析,各浓度小分子的批内CV%和批间CV%都小于15%,符合ELISA检测方法所需的精密度要求,同时没有发现同源异源分析在变异系数上存在差别。选择己烯雌酚的结构类似物双酚A、双酚戊酸、间二苯酚、苯酚,功能类似物雌二醇、壬基酚,检测同源异源ELISA方法的抗体特异性,得出无论是同源分析还是异源分析,各种类似化合物的交叉反应情况都为:双酚A>壬基酚>雌二醇>间二苯酚>苯酚>双酚戊酸,而且除了双酚A与己烯雌酚的交叉反应率大于0.1%,其余的都小于0. 1%。另外,同源分析和异源分析对于类似化合物的特异性无明显差异。在样品加标回收实验中,因同源异源ELISA方法的线性范围不同,每一种方法各选择添加3个浓度水平的DES标准品,检测所建立方法的准确度,结果显示添加回收率都在70%～120%之间,符合ELISA方法对添加回收率的要求。综上,本实验比较分析了半抗原结构异源检测小分子的灵敏度、准确度和精密度。相对于同源ELISA方法,异源ELISA方法提高了检测灵敏度,同时使最低检出限也降低了一个数量级,其在精密度实验、抗体特异性实验及样品加标回收实验上与同源ELISA方法没有明显差异。异源ELISA方法为动物性食品中己烯雌酚残留的快速、灵敏、简便的检测技术奠定了基础,进而为农兽药残留监控提供了技术支持。

论文目录

• 部分英文缩略词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 研究目的和意义
• 2 己烯雌酚概述
• 2.1 理化性质
• 2.2 应用
• 2.3 毒副作用
• 2.4 检测方法
• 3 同源异源ELISA检测
• 第一章 己烯雌酚完全抗原的合成及鉴定
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器及耗材
• 1.1.3 主要溶液的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 己烯雌酚完全抗原的制备
• 1.2.2 己烯雌酚完全抗原的鉴定
• 1.2.2.1 SDS-PAGE法鉴定完全抗原
• 1.2.2.2 质谱法鉴定完全抗原
• 1.2.3 完全抗原的蛋白定量
• 1.3 结果
• 1.3.1 己烯雌酚完全抗原鉴定结果
• 1.3.2 完全抗原的蛋白定量
• 1.4 结论与讨论
• 第二章 己烯雌酚多克隆抗体的制备及纯化
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器及耗材
• 2.1.4 主要溶液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 动物免疫
• 2.2.2 实验动物抗血清效价的测定
• 2.2.3 家兔多克隆抗体的纯化
• 2.2.4 硫酸铵分级沉淀重悬液的鉴定
• 2.2.5 纯化后多克隆抗体的蛋白定量
• 2.3 结果
• 2.3.1 实验动物血清效价测定结果
• 2.3.2 饱和硫酸铵分级沉淀多克隆抗体的鉴定结果
• 2.3.3 纯化后多克隆抗体的蛋白定量
• 2.4 结论与讨论
• 第三章 己烯雌酚同源异源ELISA检测
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器及耗材
• 3.1.3 主要试剂的配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 同源异源ELISA方法工作浓度的测定
• 3.2.2 同源异源ELISA方法标准抑制曲线的绘制
• 3.2.3 同源异源ELISA方法的精密度实验
• 3.2.4 同源异源ELISA方法的特异性实验
• 3.2.5 同源异源ELISA方法的样品加标回收实验
• 3.3 结果
• 3.3.1 同源异源ELISA方法抗原抗体工作浓度的确定
• 3.3.2 己烯雌酚标准曲线的绘制
• 3.3.3 同源异源ELISA方法的精密度实验结果
• 3.3.4 同源异源ELISA方法的特异性实验结果
• 3.3.5 同源异源ELISA方法的样品加标回收结果
• 3.4 结论与讨论
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢