大豆FAD2基因的克隆及蒺藜苜蓿、大豆P450超基因家族的鉴定

论文摘要

脂肪酸是所有生物膜的主要组成成分，油料作物如大豆、油菜种子中储存的脂肪酸常以三酰甘油酯（TAGs），即在甘油骨架上附连三个脂肪酸的形式存在，而脂肪酸的主要成分是16至18碳、含一至三个双键的脂肪酸。种子储存脂中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例是影响食用油品质的一个重要因素，比如，高油酸、低多不饱和脂肪酸的植物油是健康的、稳定的和高品质的食用油。因此，了解脂肪酸脱氢的调控机理，提高油酸的相对含量，增加油酸／亚油酸的比值，已成为油料作物品质改良育种的重要内容。在植物中油酸脱氢生成亚油酸主要由两种途径来完成：位于微粒体的ω-6脂肪酸脱氢酶催化的真核途径和位于质体的油酸脱氢酶催化的原核途径。大豆是主要食用油的来源之一，大豆中已经克隆了两个不同的微粒体油酸脱氢酶基因，种子特异表达的FAD2-1基因和组成型表达的FAD2-2基因。FAD2-1基因编码的油酸脱氢酶主要催化种子发育过程中作为储存脂成分的油酸转变为亚油酸，FAD2-2基因在营养组织和种子中表达，所编码的油酸脱氢酶主要负责细胞膜脂中的多不饱和脂肪酸的生成。作为本研究的内容之一，我们在大豆中克隆了两个微粒体油酸脱氢酶基因FAD2-1B和FAD2-3，对克隆的基因进行功能和组织表达分析，并对低温胁迫对大豆组成型表达的油酸脱氢酶基因FAD2-2和FAD2-3的影响作了分析。根据植物中克隆的油酸脱氢酶的保守氨基酸序列设计简并引物进行RT-PCR扩增，获得一个大约900bp的cDNA片段，根据获得的部分序列设计基因特异性引物，通过RACE获得该cDNA的3′和5′序列，得到全长为1，570 bp的cDNA序列。序列分析结果表明，该序列具有一个长度为1，149 bp、编码383个氨基酸的开放阅读框。与报道的油酸脱氢酶一样，推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和4个跨膜疏水结构区。该序列为一个新的编码油酸脱氢酶的基因，命名为FAD2-3基因。为了验证其功能，把开放阅读框序列亚克隆到表达载体pYES2，转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1进行表达。气相色谱分析表明，该序列在酿酒酵母中获得表达。编码的酶具有油酸脱氢酶活性，能将酵母中内源性的底物油酸转化为亚油酸。半定量RT-PCR和数字Northern分析表明，FAD2-3是一个组成表达基因，在所检测的营养组织和发育的种子中表达。低温胁迫分析表明，大豆生长在正常温度下用低温处理所导致叶片中脂肪酸组分的变化及调节机制不同于生长在低温条件下脂肪酸组分的变化及调节机制。低温处理导致叶片组织中亚麻酸含量升高、亚油酸含量降低，油酸脱氢酶基因FAD2-2、FAD2-3转录表达量不受诱导，可能是亚油酸脱氢酶基因（FAD3）被诱导高表达的结果。用简并引物对大豆不同组织来源的RNA进行RT-PCR扩增时，获得另一个不同的大约900 bp的cDNA片段，结合已测序大豆基因组序列，我们克隆了该cDNA片段的全长及其启动子序列。序列比对发现该cDNA所编码的氨基酸序列与大豆中克隆的油酸脱氢酶FAD2-1同源性很高，推测该序列可能编码种子特异表达的油酸脱氢酶，命名为FAD2-1B基因。序列分析结果表明，FAD2-1B具有一个长度为1，134 bp、编码378个氨基酸的开放阅读框。与其他的油酸脱氢酶一样，推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区和4个跨膜疏水结构区。把FAD2-1B基因开放阅读框序列亚克隆到表达载体pYES2，并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1进行功能验证，结果发现FAD2-1B基因编码的酶可以把酵母中的油酸转变为亚油酸，表明所编码的酶具有油酸脱氢酶活性。半定量RT-PCR和数字Northern分析表明FAD2-1B是一个种子特异性表达的基因，在发育种子的子叶中表达，在开花后22天左右的表达量最高。FAD2-1B可能与FAD2-1A一起共同催化种子发育过程中作为储存脂成分的油酸转变为亚油酸，决定着大豆种子中多不饱和脂肪酸的含量。在FAD2-1B基因的启动子区鉴定出一些与基因表达调控有关的顺式作用元件，其中有最基本的启动子元件TATA盒、CAAT盒，种子特异性启动子元件E-box，光反应相关的GT-1保守序列等，为功能验证提供了基础。来源于亚麻酸途径的脂肪酸羟基化产物是羟基脂的前体，羟基脂在植物生长发育的许多方面起着重要作用。丙二烯氧化物酶（AOS）和脂肪酸羟化裂解酶（HPL）是催化脂肪酸羟基化产物向不同分支羟基脂代谢的、植物特异性的P450。来源于AOS途径的羟基脂代谢产物是植物对昆虫侵害和一些发育过程中主要的信号分子；由HPL催化途径产生的羟基脂代谢产物是植物果实、绿叶等组织特征性气味的主要成分。此外，P450还广泛参与植物的次生代谢、催化多种化学反应，在植物生长发育、防御生物免受外界侵害等方面有重要作用。然而，在豆科模式植物蒺藜苜蓿和最重要的豆科作物大豆中只鉴定出少量的P450基因。作为本研究的另一部分内容，我们运用生物信息学方法和网上资源，在全基因组水平上对蒺藜苜蓿和大豆的P450序列进行鉴定、克隆与分析，对鉴定的P450序列按标准命名系统命名、进行结构与功能分析、运用数字Northern进行组织表达分析。此外，我们对P450超基因家组在拟南芥、水稻、蒺藜苜蓿和大豆中进行了比较基因组分析。在豆科模式植物蒺藜苜蓿基因组中，我们在TIGR蒺藜苜蓿consensuscontigs数据库（Release 8.0）和GenBank的nr和GSS数据库中用同源搜索的方法鉴定了152个P450序列，根据P450标准命名系统对大部分没命名的序列进行命名。所鉴定的P450序列分为9个集团的45个家族，其中的4个集团、22个家族是豆科植物中新发现的。根据结构已知的P450BM3（CYP102）序列和底物识别的区域已知的P450cam序列，把二级结构元件、底物识别部位和底物结合位点定到比对的蒺藜苜蓿P450代表序列中。数字Northern和部分序列的半定量RT-PCR分析表明大多数P450序列在蒺藜苜蓿中的表达没有组织差异性，一部分序列在根、种子、花、茎等组织中特异或大量表达。对蒺藜苜蓿P450超基因家族进行基因组范围内的鉴定、分析为深入研究豆科植物P450的种类、功能提供了基础。在大豆基因组中我们鉴定了56个P450基因，根据P450标准命名系统对没命名的序列进行命名。所鉴定的大豆P450与植物中已知P450家族代表序列构建的进化树分析把整个P450分为A-型和Non-A-型两大类。大豆基因组中的P450与拟南芥基因组中246个P450基因、水稻基因组中356个P450基因和蒺藜苜蓿基因中151个P450基因比较分析表明：所有存在大豆中的P450家族在拟南芥和蒺藜苜蓿基因组中都有相应的成员存在，大豆中所有的P450亚家族在蒺藜苜蓿中都有成员存在，CYP93C是豆科植物特有的P450亚家族。来源于ESTs的表达谱分析（数字Northern）发现一些P450亚家族在蒺藜苜蓿和大豆的组织中有相同的表达模式。这些分析有助于在大豆基因组中鉴定克隆重要的未知P450基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物脂肪酸研究进展
• 1 脂肪酸的种类
• 2 植物脂肪酸的生理功能
• 2.1 脂肪酸与植物抗寒性
• 2.2 脂肪酸在信号与防御过程中的作用
• 2.3 植物一般脂肪酸的食用价值
• 2.4 植物脂肪酸的工业价值
• 3 植物脂肪酸合成的一般途径
• 4 基因工程在改善植物脂肪酸中的应用
• 4.1 基因工程改造植物中油酸的含量
• 4.2 特殊用途高硬脂酸的植物基因工程
• 4.3 基因工程改变油菜中芥酸的含量
• 4.4 含有少量饱和脂肪酸低棕榈酸植物的基因工程
• 4.5 植物中特殊饱和脂肪酸高月桂酸油生物合成的基因工程
• 4.6 植物中长链多不饱和脂肪酸生物合成的基因工程
• 4.6.1 多不饱和脂肪酸的来源及其生物合成途径
• 4.6.2 多不饱和脂肪酸生物合成的基因工程
• 第二章 植物细胞色素P450研究进展
• 1 P450的生化特征及命名
• 2 P450的鉴定、分离和纯化
• 3 植物P450基因的克隆和异源表达
• 4 P450基因在植物改良中的应用
• 4.1 创造雄性不育系
• 4.2 培育抗除草剂的作物品种
• 4.3 生产具有重要医药价值的天然化合物
• 4.4 改良植物的抗虫、抗逆性
• 第二部分 研究报告
• 第三章 大豆油酸脱氢酶基因（FAD2-3）的克隆与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料与生长条件
• 1.2 总RNA的提取与cDNA第一链的合成
• 1.3 油酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆
• 1.4 油酸脱氢酶基因cDNA全长的克隆
• 1.5 半定量RT-PCR分析
• 1.6 数字Northern分析
• 1.7 转化载体的构建及酵母细胞的表达
• 1.8 脂肪酸分析
• 1.9 系统发育分析
• 1.10 序列分析
• 1.11 序列登录号
• 2 结果与分析
• 2.1 大豆油酸脱氢酶基因（FAD2-3）的克隆与序列分析
• 2.2 FAD2-3基因在酿酒酵母中的表达及产物分析
• 2.3 FAD2-3的组织表达分析
• 2.4 低温胁迫下FAD2-3的mRNA表达分析
• 3 讨论
• 第四章 大豆种子特异性油酸脱氢酶基因（FAD2-1B）的克隆与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料与生长条件
• 1.2 总RNA的提取与cDNA第一链的合成
• 1.3 大豆基因组DNA的提取
• 1.4 油酸脱氢酶基因cDNA片段的克隆
• 1.5 油酸脱氢酶基因cDNA全长的克隆
• 1.6 油酸脱氢酶基因启动子序列的克隆
• 1.7 半定量RT-PCR分析
• 1.8 数字Northern分析
• 1.9 转化载体的构建及酵母细胞的表达
• 1.10 脂肪酸分析
• 1.11 系统发育分析
• 1.12 序列分析
• 1.13 序列登录号
• 2 结果与分析
• 2.1 FAD2-1B基因的克隆与序列分析
• 2.2 FAD2-1B基因在酿酒酵母中的表达及产物分析
• 2.3 FAD2-1B基因的组织表达分析
• 2.4 FAD2-1B基因启动子序列的克隆与分析
• 3 讨论
• 第五章 蒺藜苜蓿P450超基因家族的全基因组鉴定与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料与生长条件
• 1.2 总RNA的提取与cDNA第一链的合成
• 1.3 蒺藜苜蓿P450s序列的鉴定和命名
• 1.4 P450s的进化分析
• 1.5 蒺藜苜蓿P450s的结构与功能分析
• 1.6 蒺藜苜蓿P450s数字Northern分析
• 1.7 半定量RT-PCR分析
• 1.8 序列分析软件
• 1.9 序列登录号
• 2 结果与分析
• 2.1 蒺藜苜蓿P450s超基因家族的鉴定与序列分析
• 2.2 P450s超基因家族的进化分析
• 2.3 蒺藜苜蓿P450s结构与功能的分析
• 2.4 蒺藜苜蓿P450s数字Northern分析
• 3 讨论
• 第六章 大豆P450超基因家族的鉴定与比较基因组分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料与生长条件
• 1.2 总RNA的提取
• 1.3 大豆P450s序列的鉴定和命名
• 1.4 P450s的进化分析
• 1.5 大豆P450s的结构与功能分析
• 1.6 大豆P450s数字Northern分析
• 1.7 半定量RT-PCR分析
• 1.8 序列分析软件
• 1.9 序列登录号
• 2 结果与分析
• 2.1 大豆P450s超基因家族的鉴定与序列分析
• 2.2 P450s超基因家族的进化分析
• 2.3 大豆P450s结构与功能的分析
• 2.4 大豆P450s数字Northern分析
• 2.5 拟南芥、水稻、蒺藜苜蓿和大豆P450比较基因组分析
• 3 讨论
• 全文结论
• 附录1 大豆中根据组织来源合并后的ESTs文库
• 附录2 蒺藜苜蓿中根据组织来源合并后的ESTs文库
• 附录3 蒺藜苜蓿P450数字表达谱分析
• 附录4 大豆P450数字表达谱分析
• 参考文献
• 攻读博士期间发表或待发表的研究论文
• 致谢