论文摘要
生殖细胞缺陷症（germ cell deficient,gcd）突变体小鼠,成年不育,它是男性缺精症和女性卵巢早衰的重要疾病模型。FancL（也叫Pog,proliferation of germ cells）的缺失是引起gcd突变小鼠的原因。FANCL是一种含有PHD结构域的泛素E3连接酶,参与DNA的损伤修复。睾丸生殖细胞特异的基因Ggn的表达产物GGN1和GGN3与FANCL相互作用。Ggn通过不同的剪接,产生三种不同的蛋白GGN1、GGN2、GGN3,其中GGN3与GGN1 C端完全同源。Ggn mRNA在睾丸中的表达时相表明Ggn在精子生成中可能起重要作用:尽管GGN1与FANCL相互作用,但GGN1参与的细胞过程还不清楚。揭示更多的参与该过程的蛋白质,特别是功能已知的蛋白质,为GGN1的功能研究以及了解精子生成过程具有重要价值。 本研究利用酵母双杂交技术,以GGN1蛋白的两个不同区段为诱饵蛋白,筛选成年小鼠睾丸cDNA文库,获得三个与GGN1有潜在相互作用的蛋白:GGNBP1、GGNBP2、OAZ3。我们制备了GGNBP2、GGN1高特异性多克隆抗体并进行了纯化、鉴定;通过细胞共定位和免疫共沉淀实验确证了GGN1与GGNBP2在哺乳动物细胞中的相互作用,通过构建突变体共转染酵母细胞确定了相互作用的区域即GGNBP2 N端400个氨基酸残基与GGN1 C端82个氨基酸残基足以介导两者的相互作用;两蛋白经翻译后修饰分子量变大。 GGNBP2原名DIF-3,在成年睾丸中高表达;脊椎动物的GGNBP2高度保守,如鸡与哺乳动物的GGNBP2有90%以上的同源性;但GGNBP2是一个功能未知的蛋白质,为此,本文对Ggnbp2的表达进行了研究,Northern blot实验结果表明:在成年小鼠的不同组织中,Ggnbp2基因mRNA在睾丸中有高表达,而在非睾丸组织中表达量很低;Ggnbp2基因mRNA的表达随小鼠年龄增大而升高。另外RT-PCR实验显示:小鼠睾丸组织的pre-mRNA的剪接方式与非睾丸组织的剪接方式不同。本研究为GGN1的功能研究、生殖细胞的发育调控、男性不育的治疗和节育措施的研究奠定了基础。
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