谢婷梁宁生(通讯作者)
（广西医科大学附属肿瘤医院药学部广西南宁530021）
【摘要】目的：研究胸腺五肽及其衍生肽在体外对不同细菌的杀菌活性。方法：根据胸腺五肽结构分别设计合成4种衍生肽如下：①胸腺五肽P5；②直肽链P10；③直肽链P12；④环肽P环。采用琼脂铺板计数法，测定衍生肽的杀菌活性。结果：P5、P10、P12对G+菌和G-菌有一定杀菌活性，其杀菌活性由强到弱依次为P12>P10=P5，P环没有杀菌活性。结论：胸腺五肽及其衍生肽P5、P10、P12对G+菌和G-菌有较弱的杀菌活性，P12环经过修饰成环状后，无杀菌活性，这可能与其疏水性和分子结构有关系。
【关键词】胸腺五肽；衍生肽；杀菌活性
【中图分类号】R687【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）10-0086-03
StudyonTheRelationshipBetweenStructureandBactericidalActivityofThymopentinpeptideanditsderivatives
XieTing,LiangNingsheng
DeptofPharmacy,AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021
【Abstract】ObjectiveTostudythebactericidalactivityofThymopentinpeptideanditsderivedpeptidesinvitro.MethodsAccordingtotheaminoacidsequenceofThymopentin,fourpeptidesweresynthesizedrespectivelyasfellow：①ThymopentinP5;②StraightpeptideP10;③StraightpeptideP12;④RingpeptidePring,.Thebactericidalactivitywasdeterminedbyagarplating-method.ResultsP5、P10、P12possessedbactericidalactivityagainstG+andG-bacteria,itsbactericidalactivityfromstrongtoweakwasP12>P10=P5.Pringhavenobactericidalactivity.ConclusionThymopentinpeptideanditsderivedpeptidesP5、P10、P12possessweakbactericidalactivityagainstG+andG-bacteria.Pringhavenobactericidalactivity.It’sbactericidalactivityisrelatedtohydrophobicityinthepeptidemolecule.
【Keywords】Thymopentin;derivedpeptides;bactericidalactivity、
具有杀菌活性的抗菌肽大多数是阳离子抗菌肽，带正电荷，肽分子中含有较多碱性氨基酸[1-2]，我们在研究磷脂酶A2衍生肽时也发现，含较多碱性氨基酸，带正电荷的衍生肽杀菌活性较强[3-4]。胸腺五肽（Thymopentin）是由精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、缬氨酸和酪氨酸组成的肽段片链[5]，也属于碱性肽，带1个净正电荷，跟我们之前研究的抗菌蛋白有相似的结构特点，很有可能有杀菌活性。因此，笔者尝试对胸腺五肽进行杀菌试验，发现胸腺五肽对临床常见的细菌具有一定的杀菌活性。我们在研究磷脂酶A2分子时还发现环肽对G-菌的杀菌活性比直链肽要强4倍左右[6]。因此，我们对胸腺五肽的分子结构进行延长和修饰，设计和合成了直链肽P10、P12和环肽P环，并检测其杀菌活性,研究杀菌活性与结构间的关系，报道如下：
1.材料
1.1细菌3种革兰氏阳性菌（G+菌）
粪肠球菌（Enterococcusfaecium,ATCC32088）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,ATCC26003）和枯草杆菌（Bacillussubtilis,ATCC63501）；3种革兰氏阴性菌（G-菌）：变形杆菌（Proteusbacillusvulgaris,ATCC49027）、大肠杆菌（Escherichiacoli,ATCC44113）和绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa,ATCC10104）。以上标准株均由广西医科大学微生物学教研室提供（购自中国食品药品检定研究院）。
1.2药品与试剂
P5,（批号：130408916）；P10，（批号：130408913）；P12，（批号：130408911）；P环，（批号:130408912），由上海波泰生物有限公司合成和纯化，纯度＞95%；1%小牛血清白蛋白（批号：A8010）和Hepes（批号：710B043）：北京索莱宝科技有限公司；LB营养琼脂（批号：120919）：北京路桥技术责任有限公司；LB培养基粉（批号：13052119G）：生物工程（上海）有限公司；无水CaCl2（批号：20081106）：成都科隆化工试剂厂；RPMI-1640（批号：NZD1128）：Thermo公司。
1.3仪器与设备
AnkeTGL-16C台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TU-1810S紫光分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Thermo420型恒温气浴摇床（Thermo公司）；HWS-20恒温水浴箱（江苏太仓市实验设备厂）；DRP-9272型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）。
2.方法
2.1衍生肽的制备
将衍生肽干粉离心后，溶于400ul灭菌蒸馏水，配成浓度为10g/L的溶液，分装到多个Ependorf管中，以-20℃冷冻保存。每次根据试验需要取出使用，避免反复冻溶。
2.2杀菌活性的测定
采用琼脂铺板计数法，参照文献[7]。①取过夜培养的细菌，按1﹕50比例加入3ml新鲜LB培养液，置于恒温气浴摇床中孵育2.5h（对数生长期）；②离心收集、洗涤细菌，将其沉淀物溶解于0.5ml灭菌生理盐水，以分光光度计测出吸光度（λ=660nm）达到0.1时所需细菌浓度，计算细菌稀释倍数；③制备RPMI-1640反应体系（含10mmol/LHepes、1mmol/LCaCl2和1%BSA，PH≈7.40），依次将10ul细菌（终浓度为1×109CFU/L）和10ul衍生肽（实验组）或生理盐水（对照组）加入到80ul的该反应体系中，混匀后恒温水浴；④水浴2h后，从该体系中取反应液40ul，加入360ul灭菌生理盐水，连续10倍稀释，共3次，从每一稀释倍数的稀释液中取出100ul置于无菌培养皿（直径为55mm）中，再加入6ml约55℃保温的灭菌LB营养琼脂，混匀，凝固后，电热恒温培养箱过夜培养；⑤18～24h后，取出计算细菌菌落形成单位（colony-formingunits，CFU），对照组CFU在30～300之间为可用数据。计算不同浓度衍生肽作用后的杀菌率，制作杀菌曲线，与对照组比较，重复5次，计算平均值。
杀菌率=（对照组CFU－实验组CFU）/对照组CFU×100%。
2.3统计学分析
用SPSS16.0统计软件进行分析，采用方差分析的方法。计量资料采用x-±s表示,按α=0.05水准，P<0.05，差异有统计学意义。
3.结果
3.1胸腺五肽及其衍生肽的结构和特点根据胸腺五肽的结构和特点，设计合成的4种衍生肽，分子结构资料如表1。4种肽分子都是阳离子肽，P5带有1个正电荷，P10、P12、P环延长了肽分子的长度，都带2个正电荷，其中P12、P环加入了2个疏水性氨基酸，P环是将P12修饰成环状。
4讨论
4.1胸腺五肽及其衍生肽的设计胸腺五肽属于碱性肽，携带1个净正电荷。与我们之前研究的磷脂酶A2衍生肽具有相似的结构特点。因此，笔者尝试对胸腺五肽进行杀菌实验，发现胸腺五肽对临床常见的细菌具有一定的杀菌活性，我们根据胸腺五肽结构，对胸腺五肽分子进行延长和修饰，分别设计合成了4种衍生肽如下：①胸腺五肽P5；②直肽链P10，是在胸腺五肽的氨基酸序列后加入一组胸腺五肽的氨基酸序列；③直肽链P12，是在P10的分子中加入2个脯氨酸；④环肽P环，是将P12修饰成环状。
4.2胸腺五肽及其衍生肽的杀菌活性由图1-图6可知，P5对几种临床常见的G+和G-菌具有一定的杀菌作用，但比我们之前研究的抗菌肽要弱[3,4]。在结构上，①P10在P5的基础上延长了1倍，二者所含疏水性氨基酸比例相同，肽分子带的净正电荷由+1变为+2，但杀菌活性并没有相应的提高，两者的杀菌活性没有明显差别，因此，单纯增加肽分子的碱性，并不能相应提高它的杀菌活性。②P12在P10的分子中加入2个疏水性氨基酸，二者所带的净正电荷量均为+2，疏水性氨基酸比例由20%变为33%，其杀菌活性比P5和P10都要强，因此适当增加疏水性氨基酸的含量，可以提高抗菌肽的活性；③P环将P12修饰成环状，二者所带的净正电荷量和疏水性氨基酸比例均相同，但其反而没有杀菌活性，因此当肽分子修饰成环状后，其所带正电荷和疏水性比较集中，抗菌肽会因为凝聚力太高，反而失去了抗菌活性。因此，抗菌肽杀菌活性不仅与肽分子带有的正电荷量相关，还与所含疏水性氨基酸比例和肽分子的空间结构相关。
5.结束语
胸腺五肽在临床上应用广泛，在治疗严重感染时，是通过提高机体免疫功能而发挥协同抗感染作用[8]。我们研究发现，它还可以直接杀菌，具有免疫调节和杀菌双重功效。本实验以天然胸腺五肽为模板，设计合成了4种肽分子，对其结构和杀菌活性进行了研究，虽然杀菌活性不高，但为以后开发出既具有免疫调节活性，又具有杀菌活性双重功能的药物提供了一定依据。
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基金项目：广西自然科学基金资助项目（NO.2013GXNSFAA019250）；广西医药卫生重点科研课题（NO.重2011075）