论文摘要
研究目的：脑血管疾病具有发病率、致残率和死亡率高的特点，随着人口老龄化的加剧，缺血性脑血管病已成为严重威胁人类健康和生活质量的主要疾病之一，成为世界医药学界普遍关注的热点研究课题。缺血性脑血管病的病理生理机制迄今尚未完全明确，亦无理想的防治药物。本研究采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，以神经功能学评分、脑水肿和梗死体积百分率及脑组织病理形态学变化为主要评价指标，观察超低分子量肝素（ULMWH）拮抗脑缺血再灌注损伤的作用，通过对脑组织能量代谢、Ca2+超载、氧化应激、兴奋性氨基酸递质、炎症反应、细胞凋亡以及相关基因表达的检测，从整体动物、细胞、分子、基因水平探讨ULMWH对大鼠缺血再灌注损伤作用的可能机制，为该化合物发展为防治缺血性脑血管病的新型药物提供理论基础和实验依据。研究方法：本研究采用经典的栓线致可逆性大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）的方法造成局灶性脑缺血再灌注损伤模型，大鼠随机分为假手术组、局灶性脑缺血再灌注损伤（模型）组、ULMWH高、低剂量组以及低分子量肝素（LMWH）对照组，各组于缺血及再灌注后10 min尾静脉给药两次，假手术组和模型组给予生理盐水，进行以下四部分试验：1．ULMWH对局灶性脑缺血再灌注损伤的拮抗作用主要从药效学方面观察ULMWH对局灶性脑缺血再灌注损伤的拮抗作用。①神经功能学评价和体重测定：大鼠术前称重，脑缺血2 h再灌注24 h后，进行5分制神经功能评分检测动物神经损伤程度，随后对大鼠进行称重并计算体重减轻的百分率。②脑水肿和梗死体积的测定：氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测定大鼠脑梗死体积百分比和脑组织水肿程度。③病理组织学检查：大鼠脑缺血2 h再灌注24 h后，快速全身灌流固定，断头取脑，于海马所在部位行冠状切块，固定过夜后常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。将蜡块切成4gm连续冠状切片。进行HE染色，光学显微镜下观察脑组织病理形态学变化。2．ULMWH对脑缺血再灌注神经细胞损伤的保护作用主要从生化和分子水平研究ULMWH对神经细胞损伤的保护作用。①脑组织能量代谢的测定：取缺血侧皮层制备10％脑组织匀浆，比色法测定匀浆中乳酸水平和ATP酶活性的变化。②抗氧化酶活力和脂质过氧化反应产物的测定：比色法测定匀浆超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性以及丙二醛（MDA）的含量。③谷氨酸含量测定：比色法测定谷氨酸的含量，观察ULMWH对谷氨酸释放的抑制作用。④细胞内游离钙浓度的测定：大鼠海马细胞悬液以Ca2+荧光指示剂Fura-2／AM负载，用双波长荧光分光光度法检测细胞内Ca2+的含量，观察ULMWH对神经细胞内Ca2+浓度的影响。3．ULMWH对脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响①小胶质细胞的观察：光学显微镜下观察HE染色切片小胶质细胞的变化。②NF-κB蛋白表达的检测：免疫组化法检测NF-κB的蛋白表达，一抗采用小鼠来源的单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的抗小鼠的IgG，显色采用DAB显色法。③ICAM-1mRNA表达的检测：分离缺血侧脑组织的海马，用Trizol试剂提取总RNA，取2μg进行RT-PCR反应，以β-actin作为参照检测ICAM-1mRNA的表达。4．LMWH对脑缺血再灌注神经细胞凋亡的影响①海马神经细胞凋亡的检测：取缺血侧大鼠海马组织，制备细胞悬液，过夜固定样品。以RNase A水浴消化后，加入DNA特异性荧光染料碘化丙啶（PI）避光染色，利用流式细胞仪定量分析细胞凋亡百分率。②Caspase-3 mRNA表达的检测：分离缺血侧脑组织的海马，用Trizol试剂提取总RNA，取2μg进行RT-PCR反应，以β-actin作为参照检测Caspase-3 mRNA的表达。结果：1．ULMWH对局灶性脑缺血再灌注损伤的拮抗作用（1）神经功能评价和体重测定：假手术组大鼠无明显神经功能缺损症状，局灶性缺血再灌注损伤组动物苏醒后可观察到明显的神经功能缺陷，ULMWH高剂量组与模型组相比，能明显降低神经功能学评分，与LMWH相比也有更明显的效果；假手术组大鼠体重变化较小，脑缺血再灌注损伤动物处死前可观察到明显的体重减轻，与缺血再灌注损伤组相比，低、高剂量ULMWH对缺血2 h再灌注24 h后大鼠的体重均有明显的改善作用。（2）脑水肿及梗死体积的测定：假手术组脑组织呈玫瑰红色，未见明显梗死灶，局灶性脑缺血再灌注损伤组出现大面积梗死灶，梗死范围涉及皮质、纹状体及海马。双侧大脑半球不对称，有水肿表现。ULMWH低、高剂量组以及LMWH组与模型组相比，梗死面积及水肿程度均有不同程度的降低。与模型组相比，两个剂量的ULMWH均能显著降低脑梗死体积；在降低脑水肿方面，与模型组相比也有明显的作用。ULMWH与同等剂量的LMWH相比，具有更好的效果。（3）病理组织学检查：假手术组大鼠海马组织结构正常，锥体细胞分3-5层，排列整齐，层次清晰。细胞形态正常，边界清楚，核大而圆，核仁、核膜清晰可见。缺血再灌注损伤大鼠海马组织结构明显异常，水肿明显，细胞间隙增宽。胞浆嗜酸性，胞核溶解。锥体细胞数目减少，排列紊乱，无明显层次结构。ULMWH可明显减轻神经元损伤，细胞形态结构基本正常，海马CA1区锥体细胞的病理变化显著减轻。2．ULMWH对脑缺血再灌注神经细胞损伤的保护作用（1）脑组织能量代谢的测定：与假手术组相比，脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织匀浆乳酸含量显著升高，ATP酶活力显著降低。各用药组均可显著降低乳酸含量，提高ATP酶活力，其中ULMWH高剂量组作用最为明显。（2）脑组织匀浆抗氧化酶活力和脂质过氧化反应产物的测定：与假手术组相比，脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织匀浆内MDA含量显著升高，SOD和GSH-PX活力显著降低，表明机体受自由基氧化损伤，且自身抗氧化能力降低，ULMWH在1mg kg-1的浓度下可显著降低MDA水平，提高SOD和GSH-PX的活力。（3）脑组织匀浆谷氨酸的含量测定：与假手术组相比，脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织匀浆内谷氨酸的含量显著升高，表明谷氨酸释放增多。各用药组均可显著降低谷氨酸的含量。（4）细胞内游离钙浓度测定：与假手术组相比，脑缺血再灌注损伤大鼠细胞内游离钙浓度明显升高，说明脑缺血再灌注损伤可诱导海马区神经细胞钙超载。各用药组细胞内游离钙浓度明显降低，以ULMWH高剂量组的作用最强，与同等剂量的LMWH相比也有更明显的作用。3．ULMWH对脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响（1）小胶质细胞的观察：假手术组组仅见少量的小胶质细胞，而模型组可见小胶质细胞的过量增生以及大量的嗜神经现象。各用药组都能够减少小胶质细胞的增生和嗜神经现象，以ULMWH作用最为明显。（2）NF-κB蛋白表达的检测：假手术组NF-κB蛋白表达阳性细胞少见，胞浆着色淡，再灌注损伤组可见棕黄色或棕褐色NF-κB蛋白表达阳性的细胞，分布于皮层及海马齿状回等区域，主要为胞核着色，各用药NF-κB蛋白表达明显减弱，阳性细胞着色于胞浆或核膜上，ULMWH高剂量组与同等剂量的LMWH相比具有更明显的作用。（3）ICAM-1 mRNA表达的检测：假手术组仅有少量ICAM-1 mRNA的表达，而缺血再灌注损伤组的表达比假手术组明显增强，各用药组与缺血再灌注损伤组相比均可降低ICAM-1 mRNA的表达，其中以ULMWH高剂量组的作用最强，与同等剂量的LMWH相比具有更明显的作用。4．LMWH对脑缺血再灌注神经细胞凋亡的影响（1）海马神经细胞凋亡的检测：假手术组仅有少量细胞凋亡发生，缺血再灌注损伤组大鼠细胞凋亡百分率较假手术组明显增加，各用药组细胞凋亡百分率明显降低，以ULMWH高剂量组降低细胞凋亡的作用最强，与同等剂量的LMWH相比具有更明显的作用。（2）Caspase-3 mRNA表达的检测：假手术组仅有少量Caspase-3 mRNA的表达，而缺血再灌注损伤组的表达比假手术组明显增强，ULMWH的两个剂量组与缺血再灌注损伤组相比均可显著降低Caspase-3 mRNA的表达，其中以ULMWH高剂量组的作用最强，与同等剂量的LMWH相比具有更明显的作用。结论：1．ULMWH能够减轻神经功能损伤、减小脑水肿和梗死体积、增加体重，对局灶性脑缺血再灌注损伤具有明显的拮抗作用。2．ULMWH可能通过改善能量代谢、抑制脂质过氧化反应并提高细胞抗氧化能力、阻滞细胞内Ca2+超载和抑制Glu过度释放，对脑缺血及再灌注损伤产生神经保护作用。3．ULMWH能够抑制小胶质细胞的增殖和嗜神经现象，还能显著减少NF-κB的表达并抑制其激活，从而抑制ICAM-1的表达，减轻炎症反应。4．ULMWH抑制神经细胞Caspase-3 mRNA的表达，在脑缺血再灌注损伤中具有抗凋亡作用。
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