根癌农杆菌介导的PSAG12-IPT基因转化蓝猪耳的研究

论文摘要

蓝猪耳（Torenia fournieri L.）是一种重要的热带、亚热带观花植物,盛花期较长,且具备特殊的裸露胚囊,是一种研究植物花器官发育和授粉受精过程的理想模式植物。嵌合基因PSAG12-IPT由来源于拟南芥的衰老特异表达的启动子SAG12与来源于农杆菌质粒的致瘤基因区（tmr）的编码细胞分裂素合成酶的基因（异戊烯基转移酶ipt）组成,常用于转化植物以提高被转化植物抵抗衰老的能力。 本研究利用限制性内切酶XbaⅠ消化双元载体pCAMBIA1301和载体pSG516并连接然后转化大肠杆菌DH5α最终得到的双元表达载体pHQIPT,含目的基因PSAG12-IPT、GUS报告基因、Hygromycin抗性基因。用冻融法将其导入了根癌农杆菌EHA101。 本研究以在组培苗蓝猪耳叶片为外植体,在共培养基中与根癌农杆菌EHA101pHQIPT共培养4d后,GUS瞬时表达检测90%的外植体为阳性。叶片外植体在诱芽培养基（Cef500mg/L,Hyg15mg/L）上筛选20d后移到生根培养基（Cef500mg/L,Hyg0mg/L）上培养15d,然后再移到生根培养基（Cef500mg/L,Hyg15mg/L）上筛选20d即可得到GUS染色检测为阳性的抗性芽。GUS染色检测、PCR检测、Southern blot、Northern blot确定九株抗性株为转基因植株。九株转基因株与对照的形态有所不同,表现为侧芽的无限增殖,叶片小且卷曲、根少且短,类似于细胞分裂素的过量表达。推测蓝猪耳幼苗中具有激活SAG12特异启动子的反式作用因子,使得IPT基因过量表达所致。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 一 研究概况
• SAG12-IPT基因的研究进展'>1. 细胞分离素及P_SAG12-IPT基因的研究进展
• 1.1 植物衰老及细胞分裂素
• SAG12-IPT基因研究进展'>1.2 P_SAG12-IPT基因研究进展
• 2. 蓝猪耳组织培养和遗传转化研究进展
• 2.1 蓝猪耳简介
• 2.2 蓝猪耳组织培养研究概况
• 2.3 蓝猪耳遗传转化研究进展
• 3. 根癌农杆菌介导转化的特点
• 3.1 根癌农杆菌介导基因转化的机理
• 3.2 根癌农杆菌介导基因转化的优点
• 4. 本研究的目的及意义
• 二 SAG12-IPT基因植物表达载体的构建及工程菌种的制备
• 1. 实验材料
• 1.1 载体及菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 培养基
• 2. 实验方法
• 2.1 质粒酶切
• 2.2 酶切产物的纯化
• 2.3 载体与目的基因的连接
• 2.4 大肠杆菌感受态的制备
• 2.5 连接产物转化
• 2.6 质粒的提取
• 2.6.1 提取缓冲液
• 2.6.2 提取步骤
• 2.7 载体的酶切检测
• 2.8 载体构建流程图
• 2.9 根癌农杆菌 EHA101感受态的制备
• 2.10 冻融法将载体pHQIPT转化根癌农杆菌 EHA101
• 2.11 PCR检测工程菌
• 2.11.1 菌液处理
• 2.11.2 引物设计
• 2.11.3 PCR反应体系及反应程序
• 3. 结果与分析
• 3.1 SAG12-IPT基因植物表达载体的构建
• 3.2 工程菌种的制备
• 4. 讨论
• 三 根癌农杆菌介导 SAG12-IPT转化蓝猪耳及转基因植株的检测
• 1. 实验材料
• 1.1 植物材料及菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂及试剂盒
• 2. 实验方法
• 2.1 农杆菌的活化与外植体的侵染
• 2.2 GUS基因表达检测
• 2.3 丛生芽的抗性筛选
• 2.4 转基因株的 PCR检测
• 2.4.1 引物设计
• 2.4.2 PCR反应体系及反应程序
• 2.4.3 总 DNA的提取
• 2.4.3.1 提取用溶液
• 2.4.3.2 提取步骤
• 2.5 Southern blot
• 2.5.1 总 DNA的提取
• 2.5.2 总 DNA酶切
• 2.5.3 探针制备
• 2.5.3.1 引物设计
• 2.5.3.2 反应体系及反应程序
• 2.5.4 总 DNA酶切样品转移到硝酸纤维素膜上
• 2.5.4.1 转移缓冲液
• 2.5.4.2 总DNA酶切产物电泳分离
• 2.5.4.3 转移
• 2.5.4.4 杂交
• 2.5.4.5 杂交后处理
• 2.5.4.6 显影和定影
• 2.6 Northern blot
• 2.6.1 总 RNA提取
• 2.6.1.1 器皿和试剂
• 2.6.1.2 提取方法
• 2.6.2 探针制备
• 2.6.2.1 引物设计
• 2.6.2.2 反应体系及反应程序
• 2.6.3 总 RNA样品转移至硝酸纤维素膜上
• 2.6.3.1 转移缓冲液
• 2.6.3.2 RNA样品的变性处理
• 3.6.3.3 RNA的甲醛凝胶变性电泳
• 3.6.3.4 转膜
• 3. 结果与分析
• 3.1 根癌农杆菌介导SAG12-LPT转化蓝猪耳
• 3.1.1 GUS基因的瞬时表达检测
• 3.1.2 丛生芽的抗性筛选
• 3.2 转基因植株的获得及检测
• 3.2.1 转基因植株的获得
• 3.2.2 转基因植株的检测
• 3.2.2.1 GUS基因表达检测
• 3.2.2.2 PCR检测
• 3.2.2.3 Southem blot
• 3.2.2.4 Northem blot
• 4. 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢