论文摘要
钙离子／钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ（Calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ）在学习记忆与突触可塑性中发挥了重要作用,α和βCaMKⅡ是前脑中存在的主要亚型。αCaMKⅡ亚型在突触可塑性中的作用已被广泛研究,而对于βCaMKⅡ亚型在突触可塑性中的作用却知之甚少。现采用海马齿状回（dentate gyrus, DG）区域特异性过量表达βCaMKⅡ的蛋白修饰转基因小鼠,通过离体电生理学和整体行为学技术,研究了βCaMKⅡ高表达对该脑区突触可塑性以及海马依赖的学习记忆的影响。本课题研究主要包括以下四部分：1.转基因小鼠βCaMKⅡ蛋白表达的检测Western bloting的结果显示,βCaMKⅡ在转基因小鼠海马突触小体的表达量显著高于对照组,这为我们的后续工作的开展奠定了基础。2.βCaMKⅡ-F90G转基因小鼠DG区基本突触传递及齿状回颗粒细胞的基本电生理特性分析内嗅皮层可以通过内侧穿通通路（Medial Perforant Pathway, MPP）和外侧穿通通路（Lateral Perforant Pathway, LPP）投射到达齿状回。MPP和LPP的双脉冲反应分别表现为双脉冲抑制（Paired-Pulse Depression, PPD）和双脉冲易化（Paired-Pulses Facilitation, PPF）。现采用离体脑片场电位技术,分别比较βCaMKⅡ-F90G转基因小鼠与同窝对照小鼠DG区两条通路的双脉冲反应。结果显示：与野生型同窝对照鼠相比,转基因小鼠的MPP通路的PPD现象和LPP通路的PPF现象均没有发生显著的变化,表明βCaMKⅡ在海马齿状回区域的过量表达不影响转基因小鼠MPP和LPP通路突触前递质释放功能。采用离体脑片膜片钳技术,分别测定了βCaMKⅡ-F90G转基因小鼠和野生型小鼠海马齿状回颗粒细胞（granule cell）的静息膜电位（Resting Membrane Potential, Vm）和电流电压曲线（Voltage-Current Plot）。结果显示均无显著性差异,提示：βCaMKⅡ过量表达没有改变海马齿状回颗粒细胞的基本电生理特性。3.不同频率的刺激对βCaMKII-F90G转基因小鼠DG区内侧和外侧穿通通路长时程突触可塑性分析LTD作为长时程突触可塑性的主要形式之一,被认为是学习和记忆的可能细胞突触机制。采用离体脑片场电位记录技术,研究了βCaMKII在DG特异性过量表达对MPP通路LTD的影响。我们分别采用1Hz,15min和3Hz,5min的低频诱导方法。结果显示,与同窝对照小鼠相比,低频刺激（1Hz,15min和3Hz,5min）在βCaMKII-F90G转基因小鼠上都不能诱导出显著的LTD现象,并且两组之间有显著差异。而在相同的刺激条件下,在人工脑脊液中加入βCaMKII-F90G特异性拮抗剂NM-PP1（0.5μM）能补偿βCaMKII-F90G转基因鼠海马齿状回LTD缺陷。结果表明过表达的βCaMKII亚型会减弱海马DG区的LTD。使用5Hz,3min和10Hz,1.5min刺激后,发现βCaMKII-F90G转基因小鼠海马齿状回的突触反应与基线反应相比有所减小,而对照组的却有所增大,两组之间有显著性差异。频率反应曲线显示在3Hz和5Hz之间,两组突触反应关系发生逆转,并且βCaMKII-F90G小鼠的突触可塑性频率反应曲线较野生组平缓。以上结果表明,βCaMKII在海马齿状回特异性过量表达使小鼠MPP通路的突触可塑性受损。此外,我们还采用1Hz,15min的低频诱导方法在LPP通路上得到与MPP通路相似的结果。这也符合LPP通路与MPP通路有类似的突触可塑性现象,使得"βCaMKII过量表达会减弱海马DG区的LTD现象”这一结论再次获得验证。4.βCaMKII-F90G转基因小鼠基本行为和海马依赖的学习记忆的行为学分析在进行学习与记忆相关行为学检测前,我们利用开场实验（open field）和明暗箱（light-dark transition test）等行为学方法,对βCaMKII-F90G转基因小鼠的行为及情绪表现进行了检测。结果显示,转基因小鼠与野生对照组鼠的活动量和探索性无显著差异,从而可以排除这些因素影响其学习与记忆能力的可能。为了探明小鼠海马齿状回过量表达PCaMKII对海马相关的学习记忆功能的影响,我们利用被动回避实验（passive avoidance test）,发现βCaMKII-F90G转基因模式小鼠海马依赖的记忆和消退能力与野生对照组相比均明显受损。由此推测βCaMKII在海马齿状回过量表达可能会损害小鼠的灵活性学习能力。本研究结果提示,βCaMKII的过量表达不影响小鼠海马齿状回区的突触前递质释放功能和颗粒细胞的基本电生理特性,但βCaMKII参与了海马齿状回LTD的形成,并且βCaMKII过量表达对小鼠齿状回穿通通路的突触可塑性频率反应曲线产生显著影响。此外行为学结果提示,βCaMKII-F90G转基因小鼠海马依赖的学习记忆能力受损,这可能与其突触可塑性的缺陷密切相关。
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