树突状细胞诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞抗甲状腺髓样癌的体外实验研究

论文摘要

目的：利用人体外周血来源的树突状细胞（dendritic cells, DCs）强大的抗原提呈能力和激活T细胞尤其是初始型T细胞的能力,探讨转染人甲状腺髓样癌细胞系总RNA的DC疫苗体外诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）增殖和杀伤靶细胞的效率。方法：采集正常志愿者抗凝的新鲜外周血,应用淋巴细胞分离液（Ficoll）用贴壁的方法分离单个核细胞（PBMC）,经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素4（rhIL-4）,体外诱导培养获取未成熟DC（imDC）。从甲状腺髓样癌细胞系提取总RNA后转染DC,流式细胞仪检测转染前后DC表面CD83, CD86, CD11c, CD14及HLA-DR表型的变化；同时经重组人白细胞介素2（rhIL-2）诱导扩增T淋巴细胞,转染后的DC与自体T淋巴细胞混合,刺激T淋巴细胞得到肿瘤抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,流式细胞仪检测刺激前后CD3/CD4, CD3/CD8的变化。MTT法检测致敏DC对T淋巴细胞增殖的影响和致敏DC活化的特异性CTL对甲状腺髓样癌细胞系总RNA转染的DC的体外杀伤效率。结果：提取甲状腺髓样癌细胞系总RNA,电泳显示完整未降解。体外诱导人外周血单个核细胞,流式细胞仪检测显示：未加脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）培养的DC低表达CD83, CD86, CD11c,为未成熟DC,符合转染要求；加LPS或甲状腺髓样癌细胞系总RNA培养的DC,高表达CD83, CD86, CD11c,为成熟DC,其形态典型、具备强烈刺激增殖的能力。转染后DC刺激自体T淋巴细胞5天后,CD8+的CTL比例上升（P<0.01）。甲状腺髓样癌细胞系总RNA致敏DC刺激T淋巴细胞转化为CTL后,MTT法检测其对新转染甲状腺髓样癌细胞系总RNA的DC细胞的杀伤效应,结果表明：随着效靶比增加,其杀伤效应亦显著增加（P<0.01）。结论：甲状腺髓样癌细胞系总RNA转染DC后,可促进其成熟,并有效刺激T淋巴细胞增殖为具有杀伤能力的抗原特异性CTL,进而发挥其杀伤癌细胞的作用,为甲状腺髓样癌RNA疫苗的体内试验提供了依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 对象与方法
• 1 材料、试剂、仪器
• 1.1 细胞培养材料和主要试剂
• 1.2 实验器材
• 1.3 肿瘤细胞系
• 2 方法
• 2.1 甲状腺髓样癌TT细胞株的培养
• 2.2 甲状腺髓样癌TT细胞总RNA提取与鉴定
• 2.3 外周血来源DCs体外培养、扩增及鉴定
• 2.4 DC的致敏及鉴定
• 2.5 转染后DC诱导CTL
• 2.6 CTL杀伤活性实验
• 2.7 流式细胞仪检测刺激前后T淋巴细胞表型变化
• 2.8 统计学处理
• 结果
• 1 RNA电泳结果
• 2 体外培养DC形态及增殖曲线
• 3 DC细胞表型鉴定
• 4 DC体外诱导的淋巴细胞增殖及组成变化
• 5 细胞毒性试验
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 甲状腺髓样癌生物治疗研究进展
• 综述参考文献
• 致谢