藏药甘青乌头抗菌、抗肿瘤活性研究以及兔耳草抗病毒活性研究

论文摘要

目的:对单味藏药甘青乌头提取物以及复方十八味诃子利尿丸进行了抑菌作用研究;深入考察了兔耳草提取物体内外抗HSV-2病毒活性及其机制;初步检测了甘青乌头生物碱类提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用。通过实验筛选出具有抗菌、抗病毒以及抑制肿瘤细胞增殖的活性部位。方法:本研究采用有机溶剂提取法得到甘青乌头和兔耳草全草的提取物。采用琼脂扩散法和微量稀释法以抑菌圈和最小抑菌浓度为指标对单味甘青乌头乙醇总提取物、挥发油以及生物碱类提取物和藏药复方十八味诃子利尿丸进行了体外抑菌活性研究。采用MTT法结合CPE法测定兔耳草乙醇总提取物和总皂苷对Vero细胞的毒性,以ACV为阳性对照采用空斑减少法结合定量荧光PCR法考查了兔耳草乙醇总提取物和总皂苷体外抗HSV-2病毒活性及其机制。通过建立HSV-2病毒小鼠脑炎模型和生殖器模型对兔耳草乙醇总提取物和总皂苷体内抗病毒活性进行了初步探讨。采用SRB法检测了甘青乌头生物碱类提取物对肝癌细胞HepG-2和肺癌细胞lewis增殖的抑制作用。结果:抗菌活性研究显示:单味藏药甘青乌头乙醇总提取物、挥发油以及生物碱类提取物对金黄色葡萄球菌、耐药表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢杆菌和白色念珠菌均形成了直径范围为9～19 mm的抑菌圈,提取物对各种菌种的MIC范围为0.125～25.00 mg/ml。藏药复方十八味诃子利尿丸对实验菌种具有抑制作用,形成直径范围为8～19 mm大小的抑菌圈,对各种菌的MIC范围为3.125～50 mg╱ml。抗病毒活性研究:兔耳草乙醇总提取物、总皂苷和阳性对照ACV对Vero细胞的半数中毒浓度TC50分别为0.2103 mg/ml、0.1127 mg/ml和11.02 mg/ml,对病毒直接杀灭的半数有效浓度EC50分别为0.08825 mg/ml、0.03255 mg/ml和0.2529 mg╱ml,治疗指数TI分别为2.4、3.5和44.3。抑制病毒侵入细胞作用的半数有效浓度EC50分别为0.1478 mg/ml、0.09333mg/ml和0.2105mg/ml,治疗指数TI分别为1.4、1.2和52.4。兔耳草乙醇总提取物、总皂苷对小鼠灌胃的LD50分别为1.27 g/kg和0.5g/kg。0.125 g/kg剂量组明显延长了小鼠的平均存活时间,总皂苷在该剂量组对小鼠的保护率为10%。生殖器感染小鼠给药一周后,小鼠生殖器疱疹病变出现好转,两周后小鼠基本康复。抑制肿瘤细胞增殖活性研究:甘青乌头脂溶性生物碱和水溶性生物碱对HepG-2细胞和Lewis细胞均具有明显的抑制作用,抑制作用随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强。结论:抗菌活性研究:单味藏药甘青乌头各种提取物对实验菌种抑制作用:挥发油成分＞水溶性生物碱＞脂溶性生物碱＞乙醇总体提取物。各种提取物对革兰阳性（G+）菌的抑制效应比革兰阴性（G-）菌显著一些。对耐药菌和真菌效果最好,尤其是生物碱类该特性非常突出。藏药复方十八味诃子利尿丸对革兰阳性（G+）菌比对革兰阴性（G-）菌的抑制作用强,对白色念珠菌抑制效果最好。抗病毒活性研究:对HSV-2的直接杀灭和病毒侵入细胞的阻断作用是兔耳草乙醇总提取物和总皂苷体外抗病毒的主要作用途径。提取物高剂量治疗组对HSV-2病毒引起的小鼠脑炎和生殖器感染有一定的治疗作用。抑制肿瘤细胞增殖活性研究:甘青乌头脂溶性生物碱和水溶性生物碱对HepG-2细胞和Lewis细胞均具有明显的抑制作用且抑制作用随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强,其中水溶性生物碱比脂溶性生物碱的抑制作用更加明显。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 藏药资源与分布
• 2 抗菌抗单纯疱疹病毒以及抗癌药物的研究现状
• 3 藏药抗菌抗病毒以及抗癌作用研究概况
• 4 本课题所选藏药介绍及研究概况
• 5 立题依据
• 第二章 藏药有效部位提取
• 1 药材鉴定
• 2 药材有效部位提取
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 甘青乌头提取物的制备
• 2.3.1.1 甘青乌头乙醇总提取物的制备
• 2.3.1.2 甘青乌头挥发油的制备
• 2.3.1.3 甘青乌头脂溶性生物碱的制备
• 2.3.1.4 甘青乌头水溶性生物碱的制备
• 2.3.2 兔耳草提取物的制备
• 2.3.2.1 兔耳草乙醇总提取物的制备
• 2.3.2.2 兔耳草总皂苷的制备
• 第三章 藏药提取物抗菌作用研究
• 1 单味藏药的抗菌活性研究
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 药品
• 1.1.2 菌种
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 方法
• 1.1.4.1 菌液制备
• 1.1.4.2 提取物抑菌圈测定
• 1.1.4.3 提取物最小抑菌浓度MIC的测定
• 1.2 结果与讨论
• 1.2.1 结果
• 1.2.1.1 甘青乌头提取物抑菌圈测定结果
• 1.2.1.2 甘青乌头提取物最小抑菌浓度MIC的测定
• 1.2.2 讨论
• 2 藏药复方抗菌活性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 药品
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 菌种
• 2.1.4 药液的制备
• 2.1.5 菌液制备
• 2.1.6 抑菌圈测定
• 2.1.7 最小抑菌浓度（MIC）的测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 结果
• 2.2.1.1 十八味诃子利尿丸抑菌圈结果
• 2.2.1.2 十八味诃子利尿丸最小抑菌浓度（MIC）结果
• 2.2.2 讨论
• 第四章 藏药兔耳草抗单纯疱疹Ⅱ型病毒作用研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 药品
• 1.1.2 病毒
• 1.1.3 细胞
• 1.1.4 动物
• 1.1.5 试剂
• 1.1.6 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 体外实验
• 1.2.1.1 细胞复苏
• 1.2.1.2 细胞传代
• 1.2.1.3 药物细胞毒性测定
• 1.2.1.4 病毒毒力蚀斑形成单位PFU的测定
• 1.2.1.5 药物对HSV-2的直接灭活作用（空斑减数法）
• 1.2.1.6 药物对HSV-2侵入细胞的阻断作用（空斑减数法）
• 1.2.1.7 药物对细胞免疫HSV-2的作用（空斑减数法）
• 1.2.1.8 药物对HSV-2增殖的抑制作用（空斑减数法）
• 1.2.1.9 药物对HSV-2DNA合成的抑制作用
• 1.2.2 体内实验
• 50)测定'>1.2.2.1 药物对小鼠的急性毒性(LD₅₀)测定
• 1.2.2.2 病毒脑腔模型毒力测定
• 1.2.2.3 药物对脑腔感染HSV-2小鼠的保护作用
• 1.2.2.4 药物对小鼠生殖器疱疹的治疗作用
• 2 结果与讨论
• 2.1 结果
• 2.1.1 体外实验
• 2.1.1.1 药物细胞毒性测定
• 2.1.1.2 病毒毒力测定
• 2.1.1.3 药物对HSV-2的直接灭活作用
• 2.1.1.4 药物对HSV-2吸附侵入细胞的阻断作用
• 2.1.1.5 药物对细胞免疫HSV-2的作用
• 2.1.1.6 药物对HSV-2增殖的抑制作用
• 2.1.1.7 药物对HSV-2 DNA复制的抑制作用
• 2.1.2 体内实验
• 2.1.2.1 药物对小鼠的急性毒性测定
• 2.1.2.2 病毒脑腔模型毒力测定
• 2.1.2.3 药物对脑腔感染HSV-2小鼠的保护作用
• 2.1.2.4 药物对生殖器感染HSV-2小鼠的治疗作用
• 2.2 讨论
• 第五章 藏药甘青乌头生物碱抑制肿瘤细胞增殖作用研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 药品
• 1.1.2 细胞
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞复苏
• 1.2.2 细胞传代
• 1.2.3 甘青乌头生物碱对Lewis细胞的增殖抑制作用
• 1.2.4 甘青乌头生物碱对HepG-2细胞的增殖抑制作用
• 2 结果与讨论
• 2.1 结果
• 2.1.1 甘青乌头生物碱对Lewis细胞的增殖抑制作用
• 2.1.2 甘青乌头生物碱对HepG-2细胞的增殖抑制作用
• 2.2 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢