论文摘要
以本实验室自建杂色鲍（Haliotis diversicolor）TBT暴露及副溶血弧菌诱导的ESTs数据库和鲍NCBI数据库为基础,经过生物信息学软件筛选获得性腺发育及应激诱导相关的基因序列150个,其中140个可归类于GO数据库中的细胞组分、生物学过程和分子功能。采用体内注射1μg/g（wt）TBT和TPT,分别暴露6h、24h、48h后解剖鳃、外套膜、性腺和肝胰腺组织作为材料,提取总RNA,利用q RT-PCR方法研究6个候选内参基因的表达变化和稳定性,鉴定有机锡暴露过程用于m RNA表达分析的内参基因,随后通过引物设计和验证,得到可采用的杂色鲍性腺发育及应激诱导相关基因共109个,筛选64个候选基因再运用q RT-PCR方法进一步对各基因进行表达分析,获得在不同组织和不同时相对TBT和TPT响应的基因共36个,最终选择了2个内参和30个效应基因构建了Real-time Q PCR芯片,具体结果如下:1)运用Ge Norm、Norm Finder和Ref Finder程序分析在不同有机锡暴露6h、24h、48h后鳃、性腺、肝胰腺和外套膜组织样品中ACT、18S r RNA、28S r RNA、ELFA、RPL8（ribosomal protein L8）、TUA（tubulin alpha）6个内参基因的表达稳定性,结果表明,杂色鲍在有机锡暴露后,ELFA可作为鳃、性腺以及所有样本组织中的最适内参,而18S和ACT分别作为肝胰腺和外套膜组织中的内参更合适,并用于校正和标准化之后的Real-time Q PCR芯片数据;同时,经过各内参基因校正来分析RXR基因在有机锡暴露6h后性腺组织中的表达情况,结果表明,在特定试验条件下,最适内参的筛选对于基因表达分析非常关键。2)运用q RT-PCR方法研究杂色鲍性腺发育及应激诱导相关基因对不同有机锡暴露的响应,筛选得到不同有机锡暴露、不同组织、不同时相中存在着显著性变化（P≤0.05）的基因36个。这些基因主要可分为免疫相关、解毒代谢相关和细胞周期相关共三类,其中与免疫相关的基因有10个:巨噬细胞表达蛋白1（MEP1）、胸腺肽（TMSB）、Ras相关核蛋白（Ran）、白介素1受体相关激酶4（IRAK4）、Ring-box蛋白（RBX）、组织蛋白酶L2（CTSL2）、高速泳动蛋白（HMG1）、激素原转换酶1（PC1）、胞嘧啶脱氨酶（CDA）、吲哚胺加双氧酶外显子1-13（IDO1-exon）。与解毒代谢相关的基因有5个:细胞色素氧化酶亚基III（COXIII）、细胞色素C氧化酶多肽5B（COX5B）、谷胱甘肽S转移酶亚型（GST-iso）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）、金属硫蛋白（MT）。与细胞周期相关的基因有21个:硫氧还蛋白（TRX）、DHHC型锌指蛋白（ZDHHC）、锌指蛋白1（ZFP1）、血蓝蛋白（Ab Hc）、钙网素（CAM）、钙调蛋白2（CAM2）、钙调蛋白-等位基因31（Calp31）、钙调蛋白-等位基因39（Calp39）、斯钙素/锡钙蛋白（STC）、细胞周期与凋亡调控因子1（CARP-1）、转录因子AP-4（TFAP4）、诱导转化生长因子（β-ig-h3）、真核起始因子3亚基4（IF3-4）、CCR4-NOT转录复合体亚基4（CNOT）、核糖体蛋白S20（RPS20）、核糖体蛋白L7（RPL7）、非ATP酶蛋白酶体26S亚基10（PSMD10）、泛素结合酶（UBI）、CCAAT增强子结合蛋白（CEBP）、精氨酸/丝氨酸丰富剪接因子4（SRSF4）、视黄酸X受体（RXR）。众多的细胞周期相关基因21个以及多重功能基因5个（总共26个,占总效应基因的72.2%）的变化,表明有机锡暴露显著改变了杂色鲍细胞分化和细胞凋亡等重要细胞过程,极可能引起雌性性腺组织细胞的凋亡和重编程,诱导性畸变。3)选择具有显著性差异表达的21个细胞周期相关基因、5个解毒代谢相关基因和4个免疫相关基因以及2个内参ELFA和ACT,共32个基因建成杂色鲍性腺发育及环境应激相关基因的Real-time Q PCR芯片,可为海洋环境生物监测特别是底栖动物生境的分子生物标志物和毒理芯片的进一步建立奠定基础,并为重要水产经济鲍资源保护提供理论依据。