结核分枝杆菌酯酶的表达、纯化、结晶及理化特性研究

论文摘要

结核分枝杆菌作为结核传染病的病原微生物,很早就引起了人们的关注,并对其进行过大量的研究。随着耐药结核杆菌突变株的出现,结核杆菌对绝大多数常规治疗药物都出现了不同程度的耐药性,致使结核病在全球范围内呈现回升趋势,我国每年新发肺结核病人145万人,结核病已成为我国传染性疾病中的第一号杀手。通过研究发现,结核分枝杆菌的致病性和耐受性都与其较高的酯类物质含量密切相关。而酯类的代谢主要由酯酶进行调控。所以研究此酯酶的结构和功能有助于更好了解结核分枝杆菌在致病中的作用,并针对性的研发新一代的结核病治疗药物。本文研究的酯酶基因（Esterase） rv3036c来源于结核分枝杆菌H37Rv,是其酯酶中的一种,。由于结构等相关数据的缺乏,使得对于Rv3036c在结核分枝杆菌酯代谢中的作用与功能尚不清楚。本研究工作主要包括rv3036c基因重组载体构建、Rv3036c蛋白的表达纯化、蛋白结晶以及理化特性研究。rv3036c基因重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,诱导重组Rv3036c蛋白的大量表达,经过Ni-NTA亲和层析、DEAE离子交换层析、Superdex 75凝胶过滤层析等纯化技术,得到99%以上纯度的目的蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示其分子量为25.5KD。应用分光光度法验证了其具有酯酶活性。采用气相扩散悬滴法对Rv3036c的结晶条件进行了筛选与优化,最终在一个结晶条件下获得了适合X-射线衍射的单晶。本研究建立了酯酶表达纯化、蛋白结晶及酯酶测定的有效方法,从而为下一步抗结核分枝杆菌药物设计与开发提供参考依据,具有重要的理论价值和实际应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 第一章 文献综述
• 1.1 结核分枝杆菌
• 1.1.1 生物学性状
• 1.1.2 致病性
• 1.2 结核病相关疾病的防治与耐药性现状的研究
• 1.2.1 结核病防治与现状
• 1.2.2 结核杆菌耐药机制的研究
• 1.3 酯酶性质的概述
• 1.4 酯酶蛋白的功能机制
• 1.5 结核杆菌及其酯酶的研究现状
• 1.6 本课题研究的意义与研究内容
• 1.7 论文各部分的主要内容
• 第二章 结核分枝杆菌酯酶Rv3036c生物信息学分析
• 2.1 引言
• 2.2 方法
• 2.2.1 基本理化性质分析
• 2.2.2 信号肽预测
• 2.2.3 跨膜区预测
• 2.2.4 同源性分析
• 2.2.5 结构域分析
• 2.3 Rv3036c生物信息学分析结果
• 2.3.1 Rv3036c基本理化性质分析
• 2.3.2 Rv3036c信号肽预测
• 2.3.3 Rv3036c跨膜区预测
• 2.3.4 Rv3036c同源性分析
• 2.3.5 Rv3036c结构域分析
• 2.4、结论
• 第三章 结核分枝杆菌酯酶Rv3036c的表达、纯化、结晶
• 3.1、引言
• 3.1.1 基因的克隆与表达
• 3.1.2 蛋白的分离与纯化
• 3.1.3 蛋白的结晶
• 3.2 试验材料
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 原核表达载体的构建
• 3.3.2 转化宿主蛋白的表达
• 3.3.3 融合蛋白的纯化
• 3.3.4 蛋白结晶
• 3.4 试验结果
• 3.4.1 Rv3036c重组质粒的构建与鉴定
• 3.4.2 Rv3036c的表达
• 3.4.3 Rv3036c的纯化
• 3.4.4 Rv3036c的蛋白结晶
• 3.5 结论
• 第四章 结核分枝杆菌酯酶Rv3036c的理化特性分析
• 4.1 引言
• 4.1.1 质谱分析
• 4.1.2 圆二色谱分析
• 4.2 试验材料
• 4.2.1 试剂和耗材
• 4.2.2 仪器
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 质谱分析
• 4.3.2 圆二色谱分析
• 4.3.3 酯酶活性分析
• 4.4 试验结果
• 4.4.1 质谱分析
• 4.4.2 圆二色谱分析
• 4.4.3 酶活性分析
• 4.5 结论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢