马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯的抗性风险评估及抗性分子机制研究

论文摘要

本论文采用菌丝生长抑制法测定了2007年采自黑龙江和河北省的59株马铃薯晚疫病菌对甲霜灵和嘧菌酯的敏感性,建立了该菌对嘧菌酯的敏感基线,进行了马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯的室内抗药性突变体的诱导和抗性风险评估,并开展了抗性机制的研究:1马铃薯晚疫病菌对甲霜灵和嘧菌酯的敏感性测定采用菌丝生长抑制法对采自黑龙江和河北省的59株马铃薯晚疫病菌进行了敏感性测定,结果表明河北省20株马铃薯晚疫对甲霜灵的抗性频率为100%,黑龙江的39株菌株敏感的占20.51%,抗性菌株占74.36%,抗性频率也达到相当高的水平。嘧菌酯对59株马铃薯晚疫的EC50值介于0.0062μg/mL～0.147μg/mL之间,平均EC50为0.0581（±0.0307）μg/mL,MIC均小于1μg/mL,不同菌株对嘧菌酯的敏感性频率分布呈连续性单峰曲线,接近正态分布,尚未出现敏感性明显下降的抗药群体,因此供试菌株的平均EC50值可作为马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯的敏感性基线用于将来开展田间抗性监测。2马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯的室内抗药性风险评估在室内采用紫外诱变和药剂驯化的方法均获得了马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯的抗性突变体,共获得4株抗嘧菌酯的突变体,其中两株抗性指数较低,两株（N2-4和N2-5）抗性指数较高分别为20.94和52.87倍。紫外诱变方法较药剂驯化方法更易于获得抗药性突变体,且其抗性水平高于药剂驯化方法。部分生物学性状研究显示,突变体的抗药性状稳定、产孢子囊能力、致病力与亲本敏感菌株相比没有显著差异。嘧菌酯与醚菌酯和烯肟菌酯之间存在正交互抗药性,与霜脲氰、烯酰吗啉、和代森猛锌之间均无交互抗药性。综合分析表明,马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯具有较高的抗药性风险,建议生产上应将嘧菌酯与其它无交互抗性的药剂交替使用或混合使用,以避免或延缓抗药性的产生。3马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯抗药性机制病原菌抗药性分子机制研究结果表明,与敏感菌株线粒体Cytb基因部分氨基酸序列比对,低抗菌株A32-5氨基酸序列中的98位由Phe突变为Leu（F99L）;N2-10氨基酸序列中的339位由Ile突变为Asn（I339N）;室内抗药性水平较高的突变体N-4和N-5氨基酸突变位点相同,均为氨基酸序列中的137位由Gly突变为Glu（G137E）;其中N2-5的869为碱基也发生了变化,由A变成了G,但氨基酸序列没有发生变化。根据相关甲氧基丙烯酸酯的抗性研究报道,抗性突变体发生突变的区域主要集中在Cytb序列上的氨基酸127～147和275～296位,不同的突变位点代表了不同抗性水平,在127～147位发生突变,表现高水平的抗药性,因此推测马铃薯晚疫病菌线粒体中Cytb基因的137位氨基酸的突变是靶标菌对嘧菌酯产生抗性的主要原因。4嘧菌酯与霜脲氰、烯酰吗啉和代森锰锌复配对马铃薯晚疫病菌的联合毒力嘧菌酯与3个无交互抗药性的杀菌剂按不同比例混配后的联合毒力测定表明,嘧菌酯与霜脲氰、烯酰吗啉按1:（1,2,3,4,5）混配对马铃薯晚疫病菌,均无增效作用;嘧菌酯与代森锰锌按（1:4、1:8、1:12、1:16、1:20）进行混配对马铃薯晚疫病菌的共毒系数均大于120,表明嘧菌酯与代森锰锌5个配比均有明显的增效作用,而1:16进行复配增效作用最为明显。

论文目录

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文献综述

1 马铃薯晚疫病的化学防治药剂及抗药性风险

1.1 保护性杀菌剂

1.2 内吸性杀菌剂

2 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的作用机制

2.1 对线粒体呼吸的抑制作用

2.2 旁路呼吸途径

3 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性发生现状

4 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性机制

4.1 生理生化机制

4.2 分子抗性机制

5 本研究的目的和意义

引言

材料和方法

1 试验材料

1.1 供试菌株

1.2 供试培养基

1.3 供试药剂

1.4 仪器与试剂

2 试验方法

2.1 马铃薯晚疫病标本的采集及病菌分离培养

2.1.1 马铃薯晚疫病标本的采集

2.1.2 马铃薯晚疫病菌的分离与培养

2.2 马铃薯晚疫病菌对甲霜灵和精甲霜灵的敏感性测定

2.3 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯的敏感性测定

2.4 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯抗药突变体的诱导及生物学特性

2.4.1 病菌对嘧菌酯和水杨肟酸（SHAM）的敏感性测定

2.4.2 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯突变体的室内诱导

2.4.3 抗药突变体的抗性水平测定

2.4.4 抗药突变体的生长速率及产袍子囊能力测定

2.4.5 杭药突变体的杭药稳定性测定

2.4.6 杭药突变体的致病性测定

2.4.7 活体条件下抗药突变体对药剂量的反应

2.4.8 抗药突变体的交互抗药性测定

2.5 马铃落晚疫病菌对啥菌醋抗药性机制研究

2.5.1 水杨肟酸对马铃薯晚疫病菌的毒力测定

2.5.2 水杨肟酸与嘧菌酯对马铃薯晚疫病菌的协同作用

2.5.3 基因DNA的提取

2.5.4 PCR扩增

2.5.5 琼脂糖凝胶电泳及成像

2.5.6 PCR产物的克隆

2.5.7 重组质粒的提取

2.5.8 测序及分析

2.6 啥菌醋与箱服氛、烯酞吗琳和代森锰锌复配对马铃薯晚疫病菌的联合作用

2.6.1 嘧菌酯与霜脲氰复配对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制活性

2.6.2 嘧菌酯与烯酰吗啉复配对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制活性

2.6.3 嘧菌酯与代森锰锌复配对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制活性

2.6.4 联合作用评价

结果与分析

1 马铃薯晚疫病菌对甲霜灵和精甲霜灵的敏感性

2 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯的敏感性的测定及敏感基线的建立

3 马铃薯晚疫病菌群体对甲霜灵和嘧菌酯的交互抗性分析

4 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯抗药突变体的诱导及生物学特性

4.1 菌株 KS-10和A32对嘧菌酯和SHAM的敏感性测定

4.2 抗药性突变体的获得及抗性水平的测定

4.3 抗药突变体在离体条件下的生长速率及产袍子囊量的比较

4.4 抗药性突变体抗药性稳定性测定

4.5 抗药性突变体活体致病力测定结果

4.6 抗药性突变体对药剂量的反应

4.7 抗药突变体的交互抗药性测定

5 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯抗药性机制研究

5.1 水杨肟酸对马铃薯晚疫病菌的毒力测定

5.2 嘧菌酯与水杨肟酸对马铃薯晚疫病菌的协同作用

5.3 抗性分子机制研究

5.3.1 基因组DNA的提取和回收

5.3.2 序列相似性分析

5.3.3 敏感菌株与抗药性菌株之间核苷酸和氨基酸序列比对分析

6 啥菌醋与括脉抓等3种杀菌剂复配对马铃薯晚疫病菌的联合毒力

6.1 嘧菌酯与霜脲氰复配对马铃薯晚疫病菌联合毒力

6.2 嘧菌酯与烯酰吗啉复配对马铃薯晚疫病菌联合毒力

6.3 嘧菌酯与代森锰锌复配对马铃薯晚疫病菌联合毒力

讨论

1 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯、甲霜灵和精甲霜灵的敏感性检测

2 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯抗药突变体的诱导及生物学特性

3 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯抗药性机制

4 啥菌醋与霜脉氛等3种杀菌剂复配对马铃薯晚疫病菌的联合毒力

结论

1 马铃薯晚疫病菌对甲霜灵和嘧菌酯的敏感性测定

1.1 马铃薯晚疫病菌对甲霜灵的敏感性测定

1.2 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯的敏感性测定

1.3 马铃薯晚疫病菌群体对甲霜灵和嘧菌酯的交互抗药性分析

2 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯的室内抗药性风险评估

2.1 室内抗药性突变体的诱导

2.2 抗药性突变体部分生物学性质研究

2.3 抗药性突变在活体上嘧菌酯药剂量的反应

2.4 抗药突变体的交互抗药性测定

3 马铃薯晚疫病菌对嘧菌酯抗药性机制

3.1 旁路氧化呼吸作用

3.2 抗药性分子机制研究

4 嘧菌酯与霜脲氰等3种杀菌剂复配对马铃薯晚疫病菌的联合毒力

4.1 嘧菌酯与霜脲氰复配对马铃薯晚疫病菌的联合毒力作用

4.2 嘧菌酯与霜脲氰复配对马铃薯晚疫病菌的联合毒力作用

4.3 啥菌醋与代森锰锌复配对马铃薯晚疫病菌的联合毒力作用

参考文献

致谢

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