人心果品种资源亲缘关系及其授粉亲和性的研究

论文摘要

人心果（Manilkara zapota）属稀有热带果树,有十分重要的开发利用价值。人心果上个世纪初引种至我国,但其经济价值并未得到充分认识。与其它热带果树（荔枝、龙眼、芒果等）相比,我国人心果产业发展和研究相对滞后,资源稀少、良种缺乏、.栽培技术落后,这与当前国内外人心果的市场需求很不相称。有必要在引进国外优良品种的基础上,积极开展品种资源调查、品种间亲缘关系、开花授粉生物学及优良品种选育等方面的研究工作。针对目前人心果产业发展中存在的品种混杂,分类不清,产量低等实际问题,本文采用形态和AFLP分子标记技术研究来源于美国、越南及国内共31个人心果品种资源的亲缘关系及其遗传多样性。在此基础上,选取部分品种,通过自交异交授粉试验,结合细胞显微观察,探寻人心果座果率低的原因,研究品种间亲缘关系与其异交亲和性的相关关系。为人心果授粉品种的选配、产量提高和今后育种工作奠定科学基础。表型性状研究结果表明,人心果品种资源遗传变异丰富。.20个形态特征平均变异系数达到了25.6%,品种（类型）间的欧氏遗传距离范围为1.11-10.94,平均遗传距离6.10。根据表型聚类结果,品种间亲缘关系与其地理来源有较明显的联系,不同地区的人心果品种在聚类图中有较为明显的界限。来源于美国的13个品种大致聚为三类,即AG-1亚群的A-1、A-2亚组和AG-2亚群中的B-2亚组。国内12个品种主要聚为两类,集中在AG-2亚群中的B-1和B-4亚组,特别是B-4亚组中海南的3个品种最先聚在一起,表现出极近的亲缘关系,有可能为同一品种。根据主成份分析（PCA）结果,20个表型性状中,叶片形状、果实形状与大小、花器特征和嫩梢（叶）颜色（有无褐毛）等反映了人心果64.8%的表型信息,利用这些形态特征可对25个人心果品种进行初步分类。13个美国人心果品种大致分为四大类型,一是大果类人心果,以OX为代表,第二类是叶片形状为长卵形的人心果,如Molix, Alana, Morena等,第三类果实为长卵形,如Hasya, Modella等,第四类特征不明显,但以圆果、叶片卵形为主。国内12个品种（类型）根据嫩梢（叶）颜色（有无褐毛）可分为两大类型,根据花器特征可再分出海南品种。采用梯度实验方法建立了人心果AFLP标准化实验体系,对31个人心果品种的DNA指纹图谱进行分析。从64个引物对（PstⅠ/MseⅠ）中筛选出9对引物,共扩增得到1131条带（75-500bp）,其中多态性条带1096条,多态性比例96.80%,去除曼妹人心果属的4个品种,在种的水平,多态性比例也达到了89.04%。品种间的遗传变异有大有小,多态性比例在22.19%至45.89%之间。与其他热带水果（荔枝、龙眼、香蕉）相比,品种间遗传多样性并不丰富,这与人心果分布范围狭小,品种间基因交流较少有关。31个供试品种中,28个已找到特征性条带,特征带大小一般在350-500bp之间。这些特征带在人心果品种鉴别及性状基因克隆中具有重要作用。31个品种间的遗传相似性系数范围在0.40-0.87,平均相似性系数为0.65。UPGMA聚类结果表明：所有供试材料可聚为三大类群,分别为曼妹人心果类群（MAM）和另个两个人心果亚群（SAPl, SAP2）。在相似性系数0.52处,曼妹人心果4个品种首先被区分开,聚为一类。27个人心果品种全部聚为另一大群（SAP）,其中13个美国品种,10个国内品种及1个越南品种构成SPA1亚群,表现出较近的亲缘关系。云南和湛江3个品种在相似性系数0.54处单独聚为SPA2亚群,与其他24个品种差异性较大,有可能为一新种。主坐标分析（PCOA）结果与系统聚类结果一致。分子聚类结果表明,品种间的亲缘关系与其地理来源相关性不高。群体研究结果表明：人心果种群多态性达到了94.80%0,居群间遗传变异占总遗传变异的比值（GST）为0.4883,即有51.17%的遗传变异存在于种群内,相当于自交植物的GST值,这与人心果种群结构有较大关系。我国广西人心果居群遗传多样性丰富,与美洲人心果亲缘关系最近,而云南人心果居群多样性水平较低,种群独特,应予以重点保护。通过人心果开花习性、花粉分析、细胞显微观察及授粉后座果情况调查研究表明：人心果花粉活力因品种和开放期不同而存在差异,从花蕾期到开放期,花粉活力逐渐减小,但总体高于60%。不同品种间花粉活力差异较大,海南品种高出广西品种约10个百分点；人心果花粉萌发率总体较低,开放期会达到10%左右；人心果座果率低的主要原因是由于自交不亲和,它属于一种较为特殊的配子体自交不亲和类型,花柱和子房都会对花粉管生长产生较强的抑制作用。不同品种间亲缘关系与其异交授粉亲和性之间存在相关性,亲缘关系越近,其异交亲和性也相对较差。根据亲缘关系研究结果可为今后人心果栽培中授粉株植的选配提供参考依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 绪论
• 1.1 关于人心果的研究
• 1.1.1 人心果生物学特性
• 1.1.2 人心果研究现状
• 1.1.2.1 种质资源的保存与分类研究
• 1.1.2.2 优良品种选育
• 1.1.2.3 生理特性研究
• 1.1.2.4 苗木繁育技术研究
• 1.1.2.5 栽培技术研究
• 1.1.2.6 采收及贮藏保鲜技术研究
• 1.1.2.7 人心果胶研究
• 1.1.3 人心果研究展望
• 1.1.3.1 种质资源的分类及其亲缘关系研究
• 1.1.3.2 生殖生理学研究
• 1.1.3.3 优良品种定向培育
• 1.1.3.4 贮藏保鲜及深加工技术研究
• 1.2 AFLP分子标记技术
• 1.2.1 AFLP技术的原理
• 1.2.2 AFLP技术的基本反应程序
• 1.2.2.1 模板DNA的制备
• 1.2.2.2 PCR扩增反应
• 1.2.2.3 扩增反应检测与分析
• 1.2.3 AFLP技术的特点
• 1.2.3.1 可靠性好 重复性高
• 1.2.3.2 多态性高
• 1.2.3.3 检测效率高
• 1.2.3.4 图谱构建聚类显著定位专一
• 1.2.4 AFLP技术的发展
• 1.2.4.1 限制性内切酶的选择应用
• 1.2.4.2 引物标记与结果显示
• 1.2.4.3 结果分析
• 1.2.4.4 改良的AFLP技术
• 1.2.5 AFLP技术在植物研究中的应用
• 1.2.5.1 构建植物遗传图谱
• 1.2.5.2 进行植物种质鉴别及分类研究
• 1.2.5.3 在种质资源遗传多样性及亲缘关系方面的研究
• 1.2.5.4 用于植物目的基因定位与克隆
• 1.2.5.5 用于植物分子标记辅助育种
• 1.2.6 AFLP技术的展望
• 1.3 植物自交异交亲和性研究
• 1.3.1 植物的自交与异交
• 1.3.2 自交不亲和
• 1.3.2.1 自交不亲和性的表现
• 1.3.2.2 自交不亲和性的类型
• 1.3.3 自交不亲和性的细胞学和分子生物学研究
• 1.3.4 自交不亲和性的测定方法
• 2 引言
• 3 人心果品种资源表型性状及其亲缘关系
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 表型性状调查
• 3.2.1.1 调查性状及方法
• 3.2.1.2 特性数据的数量化
• 3.2.2 数据的处理及分析方法
• 3.2.2.1 性状数据的统计
• 3.2.2.2 性状聚类分析
• 3.2.2.3 性状主成分分析（PCA）
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 表型性状分析
• 3.3.2 性状聚类分析
• 3.3.2.1 遗传距离
• 3.3.2.2 聚类结果
• 3.3.2.3 聚类结果的Mantel检验
• 3.3.3 品种资源的主成分分析（PCA）
• 3.4 讨论
• 3.4.1 人心果的分布及其品种资源现状
• 3.4.2 关于品种资源表型多样性
• 3.4.3 影响表型变异的因素分析
• 3.5 小结
• 4 人心果品种资源AFLP指纹图谱及其亲缘关系的研究
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 叶片DNA的提取
• 4.2.2 DNA提取效果检测
• 4.2.3 AFLP操作程序
• 4.2.3.1 酶切-连接体系
• 4.2.3.2 预扩增体系
• 4.2.3.3 选择性扩增体系
• 4.2.3.4 扩增产物的电泳检测
• 4.2.3.5 引物筛选
• 4.2.4 统计分析方法
• 4.2.4.1 电泳结果数据的获得
• 4.2.4.2 品种间遗传关系
• 4.2.4.3 聚类分析
• 4.2.4.4 主坐标分析（PCOA）
• 4.2.4.5 群体遗传多样性分析
• 4.2.4.6 形态标记与分子标记之间的相关性比较
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 基因组DNA提取质量
• 4.3.2 适合人心果的AFLP标准化实验体系
• 4.3.2.1 酶切-连接体系结果分析
• 4.3.2.2 预扩增体系结果分析
• 4.3.2.3 选择性扩增体系结果分析
• 4.3.2.4 人心果AFLP标准化实验体系
• 4.3.3 电泳检测结果
• 4.3.4 引物筛选结果
• 4.3.5 AFLP扩增结果
• 4.3.5.1 特征条带多
• 4.3.5.2 不同品种扩增条带有较大差异
• 4.3.6 品种间遗传多样性分析
• 4.3.7 品种聚类分析
• 4.3.7.1 品种间亲缘关系
• 4.3.7.2 聚类结果的Mantel检验
• 4.3.8 品种资源的主坐标分析（PCOA）
• 4.3.9 群体遗传多样性分析
• 4.3.10 群体聚类分析
• 4.3.11 形态标记与分子标记之间的相关性
• 4.4 讨论
• 4.4.1 人心果基因组DNA提取方法探讨
• 4.4.2 荧光AFLP方法的可行性
• 4.4.3 人心果遗传多样性水平评价
• 4.4.4 形态与分子标记的比较
• 4.4.5 关于人心果品种及其分类依据探讨
• 4.4.6 我国人心果的来源
• 4.5 小结
• 5 人心果自交异交亲和性的研究
• 5.1 试验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 花粉活力测定
• 5.2.2 花粉萌发力测定
• 5.2.3 花柱蛋白对花粉萌发的影响
• 5.2.3.1 花柱蛋白的提取
• 5.2.3.2 花柱蛋白对花粉萌发的作用
• 5.2.4 花粉进入花柱的时间及数量观测
• 5.2.5 花粉管在花柱内的生长状态荧光观察
• 5.2.6 自交异交授粉座果率调查
• 5.2.7 品种间遗传距离与授粉亲和性的相关关系
• 5.3 结果分析
• 5.3.1 花粉活力测定结果
• 5.3.2 花粉萌发力测定结果
• 5.3.3 花柱蛋白对花粉萌发及花粉管生长的影响
• 5.3.3.1 不同花柱蛋白浓度对花粉萌发的影响
• 5.3.3.2 不同花柱蛋白浓度对花粉管生长的影响
• 5.3.4 花粉在柱头上的萌发及进入花柱情况
• 5.3.4.1 花粉在柱头上的萌发情况
• 5.3.4.2 花粉进入花柱的时间及数量
• 5.3.5 花粉在花柱内的生长状态荧光观测结果
• 5.3.6 人心果自交异交授粉座果率
• 5.3.7 品种间遗传距离与授粉亲和性之间的相关关系分析
• 5.4 讨论
• 5.4.1 人心果坐果率低的原因探讨
• 5.4.2 关于人心果的自交不亲和性
• 5.4.3 花柱蛋白与自交不亲和的关系
• 5.4.4 人心果品种亲缘关系与其授粉亲和性之间的相关性
• 5.5 小结
• 6 结论与创新点
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 参考文献
• 附表
• 附图
• 附录
• 致谢