论文摘要
卵巢癌（ovarian cancer）是妇科恶性肿瘤中致死主要原因,其中上皮性癌最为常见。临床卵巢癌常规治疗是在进行最大限度的肿瘤减灭术基础上,并结合以铂类化疗药物为基础的综合治疗。但对铂类药物产生原发性或继发性的耐药导致卵巢癌治疗效果不理想,并引起绝大多数患者有复发的倾向,这也是卵巢癌五年生存率很低的主要原因。内质网是细胞内重要的细胞器,是调节蛋白质合成及合成后折叠、聚集、调节细胞的应激反应及细胞内Ca2+水平的场所。研究表明肿瘤的微环境变化（葡萄糖耗竭、缺氧）或抗肿瘤药物均可诱导内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）发生,表现为内质网腔内错误折叠、未折叠蛋白质聚集以及细胞内Ca2+平衡紊乱。随后ERS能够激活未折叠蛋白反应（unfolded protein reaction, UPR）来纠正错误折叠蛋白,缓解应激状态,具有抗凋亡、促进肿瘤细胞存活和耐药性作用。GRP78/BIP（glucose-regulated protein 78/binding immunoglobulin protein）是内质网重要的分子伴侣,在UPR中起到重要作用。研究发现包括肺癌、肝癌、乳腺癌等在内的多种恶性肿瘤中GRP78表达上调,并可通过多种途径抑制化疗药物诱导的细胞凋亡,从而使肿瘤发生化疗耐药。目前在卵巢癌中GRP78的表达情况国内外研究甚少,对GRP78的表达与卵巢癌化疗耐药的相关性国内外均尚未见报道,本研究目的是检测卵巢癌中GRP78的表达情况,并再此基础上探讨GRP78的表达与化疗耐药是否有一定的相关性,以及相应的耐药机制,为寻找卵巢癌基因治疗的新靶点提供可靠的实验依据。目的检测GRP78在卵巢癌中的表达,及其与卵巢癌发生、发展的关系,探索抑制GRP78表达对人卵巢癌细胞顺铂耐药的影响及其机制,并进一步探讨GRP78基因作为肿瘤耐药治疗新靶点的可能性。方法1.GRP78在卵巢癌中的表达（1）利用免疫组织化学方法检测正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤组织和卵巢浆液性囊腺癌组织中GRP78表达情况：GRP78表达与卵巢浆液性囊腺癌临床特征的相关性。（2）利用RT-PCR和Western-blot方法检测正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺瘤和卵巢浆液性囊腺癌组织中GRP78 mRNA和蛋白表达情况。2.抑制GRP78表达逆转人卵巢癌细胞顺铂耐药及其机制的探讨（1）人卵巢浆液性细胞系SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞的培养。（2）根据GRP78的基因序列及RNAi设计原理,构建pSilencerTM3.1-H1 GRP78 siRNA质粒并测序鉴定。（3）细胞转染,通过RT-PCR、Western-blot方法检测GRP78 mRNA和蛋白表达水平。（4）通过MTT法检测细胞生存率。（5）用PI/AnnexinV双染法进行细胞凋亡的定量检测,流式细胞仪分析计算细胞凋亡率。（6）Western-blot方法检测转染pSHlsi-GRP78质粒对CHOP蛋白表达的影口向。（7） Western-blot方法检测抑制GRP78及顺铂作用对GRP78、CHOP、pro-caspase 4、cleaved-caspase 4、pro-caspase 3、cleaved-caspase 3蛋白表达的影响。（8）用PI/AnnexinV双染法进行细胞凋亡的定量检测,流式细胞仪分析计算细胞凋亡率,检测抑制GRP78表达对顺铂诱导细胞凋亡的影响。（9）通过Western-blot方法检测p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表达变化,观察抑制GRP78表达对顺铂作用下Akt/mTOR通路活性影响。（10）用RT-PCR方法检测XBP1 mRNA剪切和CHOP mRNA表达变化。结果1.GRP78在卵巢癌中的表达卵巢浆液性囊腺癌组织中GRP78阳性细胞的比例明显高于正常卵巢组织和卵巢浆液性囊腺瘤组织,正常卵巢组织和卵巢浆液性囊腺瘤组织之间比较无显著差异；GRP78在卵巢浆液性囊腺癌组织中的表达与患者年龄、病理分级和临床分期无关。卵巢浆液性囊腺癌组织GRP78mRNA和蛋白表达明显高于正常卵巢组织和卵巢浆液性囊腺瘤组织,不同病理分级卵巢浆液性囊腺癌组织GRP78mRNA和蛋白表达无明显差异。2.抑制GRP78表达逆转人卵巢癌细胞顺铂耐药机制的探讨（1）通过酶切鉴定和测序证明pSilencerTM3.1-H1 GRP78 siRNA的重组质粒构建成功。（2）抑制GRP78表达能明显降低SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞生存率,但对SKOV3/DDP细胞生存率影响更大。（3）抑制GRP78表达诱导SKOV3细胞和SKOV3/DDP发生凋亡。（4）SKOV3/DDP细胞CHOP蛋白表达量明显低于SKOV3细胞；抑制GRP78表达能明显增加：SKOV3/DDP细胞CHOP蛋白表达。（5）顺铂对于SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞生长抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性；SKOV3/DDP细胞对顺铂耐药性远远高于其亲代SKOV3细胞,耐药指数为3.17。（6）抑制GRP78表达明显降低SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞对顺铂的IC5o。（7）顺铂可诱导SKOV3细胞发生内质网应激介导的凋亡；抑制GRP78表达能明显增加SKOV3/DDP细胞cleaved-caspase4和.cleaved-caspase3的表达和细胞凋亡率。（8）抑制GRP78表达能降低顺铂引起的SKOV3/DDP细胞p-Akt、p-mTOR表达,增加：XBP1 mRNA剪切片段和CHOP mRNA表达。结论1.GRP78在卵巢癌中高表达,可能与卵巢癌的发生、发展有一定相关性。2.RNA干扰技术可有效地沉默GRP78基因表达；抑制GRP78的表达具有逆转卵巢癌细胞顺铂耐药的作用；抑制GRP78的表达能通过抑制.Akt/mTOR信号通路,增加内质网应激相关转录因子XBP1 mRNA剪切和CHOP的表达上调：抑制GRP78的表达能通过内质网应激凋亡相关蛋白CHOP的表达上调和caspase 4活化,增加顺铂诱导细胞凋亡；抑制GRP78的表达在解决卵巢癌顺铂耐药间题及卵巢癌靶向治疗可能提供新的思路。