论文摘要
一．研究背景滑膜炎（synovitis）是多种疾病（如创伤、风湿类疾病、关节退变、结核、色素沉着绒毛结节等）在滑膜组织方面的特定的滑膜炎症反应和共同表现。膝关节是人体滑膜最多，关节面最大和结构最复杂的关节，临床上滑膜炎多表现在膝关节滑膜炎，现有滑膜组织细胞的研究资料大都来自人和动物的关节（主要是膝关节）。在类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）的发生发展中，滑膜炎进一步发展转为慢性，滑膜细胞及滑膜下结缔组织纤维异常增生并侵蚀周围软骨和关节，形成难治性的类风湿关节炎，如能找到确实可靠的方法来启动其内部调控机制，影响或改变成纤维细胞向滑膜成纤维细胞分化，有效抑制滑膜细胞的异常增生，将会对临床治疗滑膜疾病（代表病种有类风湿关节炎等），揭示其病理机制产生重要影响。类风湿关节炎（RA）是一种以关节滑膜炎症为病理中心的自身免疫性疾病。滑膜增生并形成血管翳是软骨和骨质破坏的关键因素。研究显示类风湿关节炎的发生机制中与成纤维细胞向滑膜成纤维细胞分化关系密切，滑膜成纤维细胞的异常增生导致滑膜炎并恶性进展造成关节和软骨破坏，而骨关节炎（Osteo-arthritic，OA）发展到严重阶段，滑膜增生也是一个重要的病理环节。传统医学上类风湿关节炎（RA）属于中医痹证，历节的范畴，目前RA发病原因及机制尚未完全明确。临床上尚缺乏根治方法和预防措施，传统的治疗主要针对炎症及后遗症。因此，寻求从最有效控制滑膜增生和软骨侵蚀的途径治疗RA是近几年来策略的重点。当前国内外治疗RA的常用药物有非甾体抗炎药（NSAIDS，如布洛芬）、改善病情的抗风湿药物（DMARDS，又叫慢作用药，如甲氨喋呤MTX、来氟米特等）、糖皮质激素、植物药、生物制剂以及基因疗法，其中来氟米特（leflunomide，LEF）能明显延缓病情进展，被肯定为病情改善药。中医药治疗RA不仅有良好的抗炎镇痛效果，而且对患者的生存质量有明显的改善，其毒副作用较少，并且能调节机体免疫功能，影响关节滑膜超微结构以及细胞功能。临床上发现很多治疗RA的有效方剂和单味药，我们根据长期临床经验自拟的三水白虎汤（Shanshuibaihu Decoction，SSBHD），具有显著改善RA病情的作用。RA病程活动期及慢性急性发作期其临床表现多数为关节红肿疼痛，痛不可触，或伴发热口渴，苔黄燥，脉滑数等，此为热痹证候主要依据。三水白虎汤是在经方白虎汤的基础上加减化裁而成，专为热痹（主要包括RA的热痹型）而设。其主药为水牛角、寒水石、白芥子、虎杖、鸡血藤等，其主要功效在于清热除湿、活血通络止痛。我们的研究发现，三水白虎汤可以有效地帮助控制局部炎症，消除局部肿胀，缓解疼痛。同时有助于降低实验指标如CCP、IgG-RF表明三水白虎汤对RA免疫活动产生调节作用。动物实验研究中我们以三水白虎汤和LEF分组单独治疗急性发病期的CIA模型大鼠，实验表明，三水白虎汤和LEF均能明显减轻大鼠后肢关节红热、肿胀和疼痛。从而进一步在动物实验上验证三水白虎汤治疗热痹的功效，该实验论文在发表中。国内中医药治疗和研究痹证的一直备受关注，三水白虎汤治疗热痹的作用机制目前尚不清楚，我们对该复方中药治疗RA的机理进行初步研究，通过应用中药三水白虎汤含药血清体外培养滑膜成纤维细胞观察其增殖抑制和对表达一氧化氮的影响。复方中药体外实验主要有两种方法，一种是将中药粗提物直接添加（如水煎液）作为作用细胞的处理因素，另一种是制成含药血清作为作用于细胞的处理因素。两者方法各有优缺点而含药血清法具有两大优势：一方面是体现复方药物的体内生化转化效应；另外一方面克服药物本身理化性质对实验的直接干扰。含药血清对离体系统同样也有干扰，但与直接加药法相比，血清药研究仍有很大的优越性，也是近年该领域研究的热点。二、研究目的和意义上文中述，RA病程中最明显特征是滑膜衬层里滑膜成纤维细胞的增生。为了进一步明确三水白虎汤治疗热痹（主为RA）的作用机制，我们设计从体外培养膝关节滑膜炎滑膜细胞观察复方中药三水白虎汤含药血清对滑膜细胞增殖抑制的影响，寻求三水白虎汤是否有效控制滑膜增生这一途径为其治疗RA提供实验依据，初步探讨三水白虎汤治疗热痹的作用机制。三．方法和内容1．滑膜标本来源滑膜组织取自南方医院脊柱外科住院病人膝骨关节炎患者（女，68岁，住院号274447）行膝关节镜手术中切除的滑膜组织，该患者临床表现符合热痹证候诊断标准，同时该患者诊断标准符合参照1986年美国风湿病学会推荐的膝OA诊断标准。2．三水白虎汤、来氟米特及生理盐水的含药血清分组、制备和给药将Wistar雌性大鼠15只大鼠分层随机分为三水白虎汤组（A组）、来氟米特组（B组）以及生理盐水组（即空白血清组，C组），每组5只。水煎三水白虎汤二次，混合两次煎取液进行浓缩，最终浓度为含生药1g／ml；把来氟米特片制成粉末溶于生理盐水中制成含药浓度0.18g／ml悬液。三组分别连续灌胃7天后腹主动脉取血，离心取血清处理后-20℃保存备用。3．滑膜细胞体外培养：采用组织块培养法滑膜取自OA患者关节镜手术，超净台上无菌操作。组织块接种后，置于37℃，体积分数为0.05的CO2培养箱培养，每隔1～2天换培养液1次，待有滑膜成纤维细胞长出后，去除组织块，继续培养，待细胞长满后消化，配制成细胞悬液，计数并进行滑膜B型活性鉴定，一般形态学观察后传代培养。滑膜B型细胞鉴定采用免疫组织化学法，按鼠抗人Vimentin单克隆抗体免疫组织化学链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物试剂盒（武汉博士德公司）操作进行。4．滑膜细胞增殖抑制实验：直接计数法、四甲基偶氮唑盐（MTT）检测法观察滑膜细胞的增殖，析因设计实验分组。直接计数法：取生长良好的3代细胞，制成2×106ml-1细胞悬液，分四组，分别为三水白虎汤组（A组）、来氟米特组（B组）以及生理盐水组（即空白血清组，C组），D组为不加任何含药血清的完全培养液组（即正常对照组）。采用24孔板培养，每3个孔为一个含药血清浓度，其中A、B、C三组的含药血清最终浓度分别为对应含药血清原始浓度的5％、10％、20％。在37℃，体积分数为0.05的CO2条件下培养到预定时间后消化、收集细胞，计数板直接计数，计算公式：细胞数／毫升=（4大格细胞数÷4）×10000×稀释倍数。根据结果绘制曲线。四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测把生长良好的4代细胞消化配制成以5×106ml-1液接种于96孔板，每板分A、B、C、D共4组按下列方法加液：分别在每孔加液至分别为10％、20％、30％、40％、50％终浓度的A、B、C三组含药血清和培养液（正常对照组），每板设置一个1空白调零孔不加细胞只加培养液，作为以后MTT测定OD值时调零用。接种后于37℃，体积分数为0.05的CO2培养箱孵育箱中孵育到预定时间，每孔加5mg／ml的MTT20μL继续培养4h，弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO）振荡溶解沉淀5～10分，用Multiskan MK3型全自动酶标分析仪在492nm波长下各读取每孔的吸光度（A值，也就是对应的光密度值OD值），并绘制细胞活力生长曲线。5．培养前后细胞上清中一氧化氮的检测：一氧化氮化学性质活泼，在体内代谢很快转化为NO2-和NO3-，而NO2-又进一步转化为NO3-，利用硝酸还原酶可以特异性地将NO3-还原为NO2-，通过显色深浅测定其浓度的高低。取终含药血清为20％浓度的培养液上清和对照组培养液上清，由-20℃取出，置于4℃冰箱中，解冻后，按一氧化氮试剂盒（南京建成）说明书的操作步骤进行。用HP8453型紫外-可见光分光光度仪在340nm波长下，测各样品A值。按说明书提供公式计算一氧化氮含量。6．实验结果以均数加减标准差（（?）±s）表示，用SPSS13.0软件进行分析，含药血清各组之间组间比较用析因方差分析，含药血清各组和正常对照组间采用One Way ANOVA方差分析，两两多重比较采用SNK法，检验水准α=0.05。四．结果1．组织块养72h后开始见细胞从组织快边缘伸出生长突，第6天后迅速增加，第12天左右长满瓶底70％。传代后生长较快。细胞长满瓶底消化后配制成细胞悬液，细胞计数为2.058×107ml-1苔盼蓝拒染细胞计数为2.01×107ml-1，测得活性率达97.57％。经组织块培养和酶消化法分离、纯化培养，在倒置显微镜下观察培养细胞呈梭形细胞，具有纤维样形态和特征。免疫组织化学染色示Vimentin阳性，为B型滑膜细胞特征染色。2．直接计数法C组生理盐水空白血清组和D组正常对照组两正常对照组的细胞增殖曲线走势趋同，C组和D组对滑膜细胞的生长均有显著增殖效应；当含药血清浓度增加为10％和20％时，A、B组细胞数从培养第一天后起减少显著，A、B组分别和C、D两组比较细胞数，差异有显著意义，△P＜0.001。3．MTT比色法检测A、B组分别与正常对照组D组比较细胞增殖计数：△△P＜0.001；分别与生理盐水空白血清组D组比较□P＜0.001，结果提示A组、B组分别对体外培养关节炎滑膜细胞增殖均有显著抑制作用。4．滑膜细胞在含药血清作用下，加入不同组别后（终浓度为20％）测定培养上清液中一氧化氮的含量，结果显示，三水白虎汤组（9.568±2.173μmol／L）和来氟米特含药血清组（12.919±1.320μmol／L）分别与生理盐水含药血清组（677.796±229.118μmol／L）、正常对照组（1242.597±364.949μmol／L）比较，差异均有显著性意义（P＜0.001）。五．结论（一）、生理盐水含药血清组和正常对照组对体外培养滑膜成纤维细胞增殖曲线走势趋同，均具显著增殖效应。（二）、三水白虎汤含药血清和来氟米特含药血清对体外培养滑膜细胞的增殖有显著抑制效应，该抑制效应分别和生理盐水空白血清组、正常对照组的增殖促进效应比较，差异有显著意义。（三）、三水白虎汤含药血清组和来氟米特含药血清组均能显著减少培养上清液中一氧化氮的含量，与生理盐水含药血清组、正常对照组比较差异有显著意义。（四）、复方中药三水白虎汤含药血清法对体外培养滑膜细胞的增殖有明显抑制效应，并且抑制增殖的过程中滑膜细胞分泌一氧化氮同时受到显著抑制。三水白虎汤有效控制滑膜增生这一途径可能为三水白虎汤治疗热痹（尤为RA）的重要作用机制之一，抑制滑膜成纤维细胞增生过程显著抑制其分泌一氧化氮可能为其抑制增殖过程中的重要环节。