碱性纤维素酶高产菌株的筛选及其基因的克隆与表达

论文题目: 碱性纤维素酶高产菌株的筛选及其基因的克隆与表达

论文类型: 硕士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 蔡勇

导师: 曹斌云,樊俊华

关键词: 纤维素酶,内切葡聚糖酶,基因克隆,表达,大肠杆菌,芽孢杆菌

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 纤维素作为一种丰富的可再生资源，可通过酶降解的方法转化为易发酵的糖类，从而生产酒精或其他产品。纤维素酶是这一转化过程中的关键酶之一。为了获得一株纤维素酶的高效基因工程菌，本研究通过以下试验获得了如下结果： 1．应用刚果红染色鉴定和粗酶液活力测定相结合的筛选方法，从腐烂的纸浆中筛选到一株高活力碱性纤维素酶产生菌Bacillus sp．CY1-3。该菌为芽孢杆菌，适宜在pH6.2～8.8、温度34～46℃下生长。摇瓶发酵产酶的最适温度、pH分别为34～43℃、7.8～8.8，培养36h左右达到产酶高峰。酶反应的最适温度为60℃，pH为5.5～8，并具有良好的热稳定性和酸碱稳定性，Cu2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+对酶活力具有促进作用，而Co2+和Zn2+表现明显的抑制作用。该菌产生单一的内切葡聚糖酶，在最佳条件下CMCase活力可达13.6U／mL。这种酶制剂洗涤剂在工业中具有良好的应用前景。 2．将菌株Bacillus sp．CY1-3基因组DNA用限制性内切酶Sau3AI部分消化，分离2～7kb的片段连接到用BamHI完全消化的克隆载体pBluSKM上，转化大肠杆菌DH5α，构建其基因组DNA部分文库。应用刚果红染色检测酶活性的方法，从近10万个克隆子中筛选出出6个表现纤维素酶活性的阳性克隆子。限制性内切酶切分析，6个克隆子表现为一致的图谱，视其为相同克隆子。 3．Bacillus sp．CY1-3菌株纤维素酶基因克隆片段的序列分析表明：质粒pGJc-1上2189bp的插入片段中有一个由1593个核苷酸组成的开放阅读框，命名为celC。在其推测的起始密码子ATG的上游相隔5bp处有一个潜在的核糖体结合位点AGGAGT，该序列可使mRNA和细菌核糖体16S rRNA的3’端碱基互补配对。在ORF的上游64bp处发现了一个可能的启动子序列，即-35区的TAGACA和-10区为TATAAT，两者相隔18bp，该序列与大肠杆菌的σ70所识别的保守的启动序列十分相似。 4．CelC蛋白分析表明，CelC由531个氨基酸残基组成，预计分子量大小为58，351道尔顿，等电点为10.18。将CelC蛋白氨基酸序列与GencBank中已公布的氨基酸序列对比分析，结果表明该蛋白与多种细菌的β-1，4-内切葡聚糖酶具有很高的同源性。通过NCBI的保守结构域检索，CelC有一个位于N端66～320AA之间，属于糖基水解酶家族5的催化结构域；一个位于C端391～472AA家族3碳水化合物结合组件。 5．将含纤维素酶基因的重组克隆载体pGJc-1进行亚克隆，用BamHI和SacI双酶

论文目录:

摘要

Abstract

目录

第一章 纤维素及纤维素酶的研究进展

1 纤维素的组成、结构及其利用

2 纤维素酶及其酶系的主要性质

2.1 纤维素酶的组成

2.2 纤维素酶系的主要性质

3 纤维素酶的分子结构及其催化的分子机理

3.1 纤维素酶的结构、结构域及其功能

3.2 纤维素酶催化的分子机理

4 纤维素酶的降解机理

4.1 纤维素酶对纤维素分子的吸附作用

4.2 纤维素酶的降解机理

4.3 影响纤维素酶降解的主要因素

5 纤维素酶的生产

5.1 纤维素酶的来源

5.2 高产纤维素酶菌株的选育

5.3 培养基及培养条件

5.4 纤维素酶的诱导分泌

6 纤维素酶的应用

6.1 纤维素酶在畜牧业中的应用

6.2 纤维素酶在食品发酵工业中的应用

6.3 纤维素酶在生产葡萄糖和单细胞蛋白(SCP)中的应用

6.4 纤维素酶在造纸工业中的应用

6.5 纤维素酶在酒精生产上的应用

6.6 纤维素酶在工业洗涤中的应用

6.7 纤维素酶在其他领域的应用

7 本课题的研究意义及内容

第二章 碱性纤维素酶高产菌株的筛选及其酶学特性研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

2.2 菌株的分离、筛选与鉴定

2.3 菌株的微生物学特性及产酶条件

2.4 酶学特性

3 结论

第三章 纤维素酶基因的克隆和序列分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 Bacillus sp.CY1-3基因组DNA的提取

2.2 Bacillus sp.CY1-3基因组DNA和pBluSKM质粒载体的酶切消化及纯化回收

2.3 pBluSKM质粒载体的去磷酸化

2.4 基因组DNA片段与pBluSKM载体酶切产物的连接及转化

2.5 Bacillus sp.CY1-3基因组部分文库的构建及纤维素酶基因阳性克隆子的筛选

2.6 阳性克隆子重组质粒的提取、酶切鉴定及测序

2.7 Bacillus sp.CY1-3菌株纤维素酶基因celC的序列分析

2.8 CelC的氨基酸序列分析

3 讨论

3.1 Bacillus sp.CY1-3菌株部分基因组文库的构建

3.2 基因文库的筛选

3.3 阳性克隆子的酶切分析

4 结论

第四章 碱性纤维素酶基因工程菌的构建及高效表达

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 celC基因的PCR扩增

2.2 celC基因表达质粒的构建

2.3 celC基因的克隆及重组质粒的酶切鉴定

2.4 celC基因功能表达检测

2.5 E.coli BL21菌株中重组质粒pGJc-8的稳定性

2.6 诱导表达程序的确立

2.7 celC基因在原核生物中的表达

2.8 纤维素酶分子量的测定

2.9 pGJc-8表达产物的纯化

3 讨论

4 结论

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2007-04-05

参考文献

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