五味子甲素逆转肿瘤多药耐药的效应及其机制研究

论文摘要

肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是临床化疗失败的重要原因。美国癌症协会统计,每年死亡的癌症患者中,90%以上与MDR有关,20多年来,科学家对逆转剂进行了广泛深入的研究,其中对30多种P-gp逆转剂进行了150多个临床试验,但没有一个P-gp逆转剂被FDA批准,这些逆转剂的主要缺点是毒性大、半衰期短、靶向性差、改变化疗药物的药代动力学特征,因此寻找高效、低毒的逆转剂成为了近年来国内外的一个研究热点。五味子甲素（schizandrin A,schA）是从五味子果实中分离得到的具有生物活性的一种木脂素类化合物,近年来研究表明五味子甲素有镇咳、抗艾滋病、预防和治疗胃溃疡、保肝降酶、提高免疫力及抗衰老等药理作用,并且以五味子甲素为主要成分的五酯软胶囊已经在临床广泛使用,其主要作用是能降低血清谷丙转氨酶,可用于慢性肝炎谷丙转氨酶升高者。虽然对其多药耐药方面研究较少,但仍有研究表明五味子粗提物及其有效成分五味子甲素具有逆转多药耐药的效应,鉴于此本实验对其耐药逆转药理作用进行体内外效应及体内机制进行研究。目的:本研究选取耐药机制不同的两种肿瘤细胞K562/ADR、MCF-7/ADR（P-gp高表达）、HL60/ADR（MRP1高表达）和化学结构和作用机制不同的四类化疗药物,通过MTT检测法检测不同浓度的五味子甲素与四类不同的化疗药物合用后的对其上述两种耐药机制不同细胞的抑制作用,通过IC50来观察细胞水平上逆转肿瘤MDR效应,进而评价五味子甲素的体外耐药逆转效应;通过观察体外逆转效应对其体外耐药机制进行了初步研究;通过建立人口腔癌耐药细胞株裸鼠移植瘤模型,评价五味子甲素和化疗药物合用后体内耐药逆转效应。方法:实验采用MTT法检测各肿瘤细胞的耐药性及五味子甲素对各耐药细胞的无毒剂量;以及五味子甲素对K562/ADR、HL60/ADR细胞的耐药逆转效果;人口腔癌耐长春新碱细胞株裸鼠移植瘤实验检测五味子甲素联合化疗药后的体内耐药逆转效应。流式细胞仪检测不同浓度五味子甲素作用不同耐药机制的细胞后,对细胞内柔红霉素蓄积的影响、对P-gp底物罗丹明-123蓄积的影响和对P-gp高表达细胞株的表面P-gp表达水平的影响; Real-time PCR方法检测K562/ADR细胞内mdr1mRNA、mrp1mRNA表达的影响;Elisa检测法检测细胞内GSH含量的变化。内容:1.实验采用MTT法检测K562/ADR、HL60/ADR、MCF-7/ADR肿瘤细胞对四类作用机制不同的化疗药物的耐药性,以及筛选出五味子甲素对K562/ADR、HL60/ADR、MCF-7/ADR、CCRF/TAX的无毒剂量。2.实验采用MTT法检测化学结构和作用机制不同的四类化疗药物与不同浓度的五味子甲素合用后对耐药机制不同的两种肿瘤细胞K562/ADR（P-gp高表达）、HL60/ADR（MRP1高表达）的抑制作用,通过IC50来评价体其外逆转效应。3.通过建立人口腔癌耐药（耐长春新碱）细胞株裸鼠移植瘤模型,评价不同浓度的五味子甲素和不同浓度的化疗药物长春新碱合用后体内耐药逆转效应。4.通过体外逆转实验,对体外逆转机制进行探讨。流式细胞仪检测不同浓度五味子甲素作用不同耐药机制的细胞后,对细胞内柔红霉素蓄积的影响、对P-gp底物罗丹明-123蓄积的影响和对P-gp高表达细胞株的表面P-gp表达水平的影响;Real-time PCR方法检测K562/ADR细胞内mdr1mRNA、mrp1mRNA表达的影响;Elisa检测法检测五味子甲素对细胞内GSH含量的变化。结果:1. MTT法检测结果显示:K562/ADR,HL-60/ADR和MCF-7/ADR对阿霉素的耐药倍数分别为70.8,55.7,108.6倍,与各自敏感细胞株相比较,耐药倍数分别达到30倍以上。同时我们将其它作用机制及化学结构不同的常用抗肿瘤化疗药物如DNR、PTX、VCR、5-FU等分别作用上述细胞,测得IC50,结果表明均有不同程度的耐药;同时用MTT检测法筛选出五味子甲素对K562/ADR、MCF-7/ADR、CCRF/TAX、HL60/ADR细胞的无毒剂量,其无毒剂量分别是:80μmol/L、60μmol/L、10μmol/L、40μmol/L。2.不同浓度的五味子甲素与不同的化疗药物合用后作用于K562/ADR细胞48小时后,据IC50值显示,五味子甲素逆转了P-gp高表达细胞K562/ADR对DOX、DNR、VCR、PTX的耐药性（P<0.05）,五味子甲素对逆转VCR的耐药效应最强,对蒽环类（DOX、DNR）次之,对PTX的逆转效应较差,而对5-FU无逆转作用。在MRP1高表达细胞株HL60/ADR中,五味子甲素对蒽环类（DOX、DNR）,长春碱类抗肿瘤药物表现很好的耐药逆转效果（P<0.01）,这与逆转P-gp高表达细胞株相似,但是对紫杉醇及氟尿嘧啶无逆转作用。3.在裸鼠移植瘤实验中,长春新碱合用小剂量的五味子甲素（300mg/kg）和大剂量的（450mg/kg）时,与对照组相比,均能不同程度上抑制裸鼠肿瘤的生长,其肿瘤重量抑制率分别是56.1%、72%。同时裸鼠体重也均显示了不同程度的降低;而长春新碱单药组及五味子甲素单药组对肿瘤生长无明显的抑制作用。4.体外逆转机制研究结果发现;不同浓度五味子甲素与柔红霉素共同孵育1h后,可显著增加K562/ADR、HL60/ADR、MCF-7/ADR细胞内柔红霉素浓度（P<0.05）,并且有明显的浓度依赖性,而对CCRF/TAX细胞内柔红霉素浓度无明显的增加作用;不同浓度五味子甲素与罗丹明123共同孵育1h后,K562、MCF-7细胞内罗丹明123荧光强度无增加,K562/ADR、MCF-7/ADR、CCRF/TAX、HL60/ADR细胞内罗丹明123浓度均显著增加,并且有很好的浓度依赖性;不同浓度五味子甲素作用于K562/ADR、MCF-7/ADR细胞后,对P-gp的表达均显示较强的抑制作用;不同浓度五味子甲素作用于K562/ADR细胞后,细胞内mdr1mRNA、mrp1mRNA的表达均被抑制,并且呈浓度依赖性;不同浓度五味子甲素与不同浓度多柔比星合用后,发现联合用药组与多柔比星单药组相比,能抑制多柔比星引起的细胞内GSH含量降低。结论:1.本研究检测出了K562/ADR,HL-60/ADR和MCF-7/ADR细胞株对化学结构和作用机制不同化疗药物的耐药性,结果表明细胞株符合多药耐药的性质,为后阶段的实验筛选出了合格的细胞模型;同时筛选出了五味子甲素对K562/ADR、MCF-7/ADR、CCRF/TAX、HL60/ADR细胞的无毒剂量,为体外逆转实验及体外逆转机制的研究筛选出合适的用药剂量。2.在K562/ADR细胞中,不同浓度的五味子甲素与不同的化疗药物合用后,逆转倍数结果显示:在P-gp高表达细胞株中,五味子甲素对蒽环类、长春碱类、紫杉醇类有耐药逆转作用,而对氟尿嘧啶无逆转作用,推测蒽环类、长春碱类、紫杉醇类是P-gp作用的底物,氟尿嘧啶不是P-gp作用的底物;在HL60/ADR细胞中,不同浓度的五味子甲素与不同的化疗药物合用后,逆转倍数结果显示:在MRP1高表达细胞株中,五味子甲素对蒽环类、长春碱类有耐药逆转作用,而对紫杉醇类、氟尿嘧啶无耐药逆转作用,推测蒽环类、长春碱类是MRP1作用的底物,氟尿嘧啶、紫杉醇类不是MRP1作用的底物。从以上两组细胞逆转结果说明,耐药细胞株的种类及其合用的化疗药物的种类对五味子甲素体外逆转效应起决定性作用。3.五味子甲素与化疗药物合用后,与对照组相比,体内实验也显示了很明显的耐药逆转作用,为以后的临床实验提供理论依据。4.五味子甲素逆转肿瘤多药耐药的机制推测与以下因素有关:①五味子甲素是P-gp、MRP1的底物,通过与化疗药物竞争减少药物外排,或者通过改变P-gp、MRP1的蛋白结构,减少P-gp、MRP介导的药物外排,增加化疗药物的细胞内浓度。②五味子甲素抑制肿瘤细胞表面P-gp蛋白表达,减少药物外排,增加化疗药物的细胞内浓度。③五味子甲素降低mdr1、mrp1耐药基因的表达,进而影响P-gp、MRP1蛋白表达,④五味子甲素并不是通过降低细胞内GSH含量减少由MRP1介导的药物外排,而对化疗药物引起的GSH降低有抑制作用,因GSH是细胞抗氧化剂,所以schA对细胞有保护作用。五味子甲素通过上述作用机制,进而增加肿瘤细胞内的药物浓度,达到有效杀灭肿瘤细胞的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 肿瘤多药耐药细胞株的耐药性验证及五味子甲素无毒剂量的筛选
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分五味子甲素逆转肿瘤多药耐药的体内外效应
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三部分 五味子甲素逆转肿瘤多药耐药的初步机制研究
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢