嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达、突变和酶特性研究

论文摘要

木聚糖酶能将木聚糖降解为低聚木糖和少量木糖。在饲料、食品和造纸行业等都有极大地应用前景。现在商业应用的木聚糖酶大部分都是通过工程菌大规模发酵得到的。到目前为止,来源于不同生物的多种木聚糖酶已经被成功表达于大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母和真菌等宿主。嗜热真菌DSM10635所分泌的木聚糖酶属于糖苷水解酶第11家族,其等电点为3.7,最适pH是6.5,最适温度是70℃,在pH 5.5-9.0下都具有很高的酶活性。本论文通过简并引物对嗜热真菌DSM10635的总DNA进行PCR,从而获得木聚糖酶的基因,序列比对后发现此木聚糖酶基因含有一个内含子,采用重叠延伸PCR技术除去内含子后,即得到木聚糖酶的编码序列。将编码序列与表达载体pET-22b（+）的重组质粒转化表达宿主BL21（DE3）,诱导表达得到有生物活性的木聚糖酶。酶特性分析的结果表明原核表达的木聚糖酶的最适温度为65℃,比嗜热真菌DSM10635分泌的木聚糖酶的最适温度低了一些。其热稳定性也要差一些。实验中我们对木聚糖酶基因进行了一些突变并将突变后的木聚糖酶基因表达于大肠杆菌。通过突变引物利用PCR技术将突变引入到木聚糖酶基因中。所有的突变木聚糖酶都成功的表达于大肠杆菌。突变酶酶特性分析的实验结果表明突变酶发生了一些变化。N-端单个氨基酸的突变对木聚糖酶的性质影响不大,但是加入二硫键后的木聚糖酶的性质有了明显的变化。加入二硫键后的木聚糖酶（如DSB1）的最适温度为75℃,比未突变的1YNA增加了10℃。热稳定性也有了极大的改善。在80℃处理30min后还保留有40%左右的相对残余酶活力。本文还对木聚糖酶1YNA和DSB2进行了纯化。通过硫酸铵沉淀、疏水作用层析、离子交换层析和超滤浓缩后,1YNA和DSB2的比活力分别达到5912IU/mg蛋白、6756IU/mg蛋白。纯化后的木聚糖酶为进一步的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• ABBREVIATIONS
• 第一章 绪论
• 1.1 木聚糖的介绍
• 1.2 木聚糖酶的简介及分类
• 1.3 木聚糖酶的应用
• 1.3.1 在造纸工业的应用
• 1.3.2 在食品工业的应用
• 1.3.3 在饲料工业和其他方面的应用
• 1.4 木聚糖酶的相关表达
• 1.5 木聚糖酶的相关突变
• 1.6 本文构想
• 第二章 木聚糖酶1YNA 的表达
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 引物合成
• 2.1.3 试剂盒、工具酶和试剂
• 2.1.4 实验中用到的仪器
• 2.1.5 实验中用到的培养基
• 2.1.6 实验中常用的溶液
• 2.2 木聚糖酶基因1yna 的克隆
• 2.2.1 嗜热真菌DSM10635 总DNA 的提取
• 2.2.2 木聚糖酶基因1YNA 片段的获取
• 2.2.3 相关感受态细胞的制备
• 2.2.4 PCR 产物的回收
• 2.2.5 PCR 产物的连接和转化
• 2.2.6 转化子的鉴定和序列测定
• 2.3 木聚糖酶1YNA 的表达
• 2.3.1 嗜热真菌DSM10635 总RNA 的提取
• 2.3.2 采用重叠延伸PCR 法对木聚糖酶的编码序列进行拼接
• 2.3.3 质粒DNA pET-22b（+）的提取
• 2.3.4 目的片段xyl 和质粒DNA pET-22b（+）的双酶切
• 2.3.5 目的片段xyl 和质粒DNA pET-22b（+）的连接和转化
• 2.3.6 木聚糖酶转化子的PCR 鉴定和序列测定
• 2.3.7 质粒pET-22b（+）-xyl 的提取及表达性宿主转化
• 2.3.8 原核表达木聚糖酶相关酶特性研究
• 2.4 实验结果和分析
• 2.4.1 对测序的结果进行序列比对分析
• 2.4.2 采用重叠延伸PCR 除去内含子
• 2.4.3 原核表达载体pET-22b（+）-xyl 的构建
• 2.4.4 表达转化子的酶活验证分析
• 2.4.5 酶特性结果分析
• 2.5 小结
• 第三章 木聚糖酶1YNA 的突变
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 引物合成
• 3.1.3 试剂盒、工具酶
• 3.1.4 实验中用到的仪器
• 3.1.5 主要的培养基和试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 同源建模进行突变位点的确定
• 3.2.2 进行突变时需要用到的引物
• 3.2.3 定点突变木聚糖酶的单个氨基酸（以SRS2 为例）
• 3.2.4 通过定点突变在木聚糖酶中引入二硫键（以DSB1 为例）
• 3.2.5 木聚糖酶相关酶特性的测定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 木聚糖酶SRS2 的突变结果
• 3.3.2 木聚糖酶DSB1 的突变结果
• 3.3.3 突变酶酶特性分析的相关结果
• 3.4 小结
• 第四章 相关木聚糖酶的分离纯化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 实验中用到的仪器
• 4.1.4 实验中常用的培养基和溶液
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 工程菌株的活化和培养
• 4.2.2 木聚糖酶的HIC 柱纯化
• 4.2.3 木聚糖酶的超滤浓缩
• 4.2.4 木聚糖酶的离子交换层析
• 4.2.5 目的蛋白木聚糖酶的SDS-PAGE
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 HIC 柱纯化的实验结果
• 4.3.2 DEAE 离子交换层析柱纯化的实验结果
• 4.3.3 木聚糖酶的SDS-PAGE 实验结果
• 4.4 小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录研究生期间发表的文章