甜菜谷氨酰胺合成酶基因克隆及其对氮素响应

论文摘要

糖用栽培甜菜（Beta vulgaris L.）是世界和我国两大糖料作物之一,又是我国北方特有的糖料作物。而甜菜对氮素的吸收利用能力是生长发育重要的限制因素之一。谷氨酰胺合成酶（GS）在高等植物氮代谢中起着重要的作用,是氮代谢的关键酶。GS具有多种同工酶,根据亚细胞定位,分为胞液型谷氨酰胺合成酶（GS1）和质体型谷氨酰胺合成酶（GS2）。研究甜菜GS基因的结构功能及表达调控对甜菜实现高同化氨及增产增糖有重要意义。本研究以糖用栽培甜菜为试材,利用RT-PCR方法进行甜菜胞液型谷氨酰胺合成酶mRNA（GS1mRNA）、质体型谷氨酰胺合成酶mRNA（GS2mRNA）和质体型谷氨酰胺合成酶的基因组基因（GS2DNA）的分离克隆。在此基础上,利用生物信息学手段对GS1mRNA和GS2mRNA推导出的蛋白质序列进行主要结构分析和功能预测;利用酶活测定和半定量PCR相结合的方法对GS1mRNA和GS2mRNA在氮素和核酸蛋白合成抑制剂（放线菌素D和放线菌酮）处理下的表达进行分析。通过上述研究得到以下结果:运用PCR扩增技术首次克隆了甜菜质体型谷氨酰胺合成酶的基因组基因GS2DNA（登录号为EU558132）。测序结果表明,基因组DNA长度为6144bp,含有13个外显子和12个内含子,最大的内含子长度为1576bp,最小的长度为89bp。利用RT-PCR方法成功地从甜菜叶片中克隆了已知谷氨酰胺合成酶基因GS1mRNA （登录号为AF343667）和GS2mRNA（登录号为AY026353）。获得的GS1cDNA基因长度为1071bp,与已知的GS1mRNA相似性达99.81%,只有2个碱基的差异。GS1cDNA基因可编码356个氨基酸,而且其推导出的氨基酸序列与其它植物GS1基因的具有较高的同源性。获得的GS2cDNA基因长度为1296bp,与已知的GS2mRNA相似性达99.92%,只有1个碱基的差异。GS2cDNA基因可编码431个氨基酸,而且其推导出的氨基酸序列与其它植物GS2基因的也具有较高的同源性。用ExPasy软件包和TOPPRED在线分析GS的理化特性,结果表明GS1的理论等电点PI=5.30,蛋白质相对分子量Mw=39092Da,GS2的理论等电点PI=5.91,蛋白质相对分子量Mw=47422Da,二者均为易溶、亲水性强的蛋白。并运用DNAMAN6.0软件构建了GS的系统进化树,GS1隶属于胞液型GS家族,和胡颓子（Elaeagnus umbellata）GS1的同源性很近;GS2隶属于质体型GS家族,与菠菜（Spinacia oleracea）GS2的亲缘关系最近。二级结构预测结果显示,GS1的α螺旋在24.72%左右,β折叠在16.01%左右,GS2的α螺旋在24.13%左右,β折叠在16.01%左右,表明GS为混合型蛋白。另外,应用同源建模法Geno3d进行GS三维结构的预测,GS1的β折叠区有19个折叠,折叠区间由α螺旋来连接,共有10个螺旋,GS2的β折叠区有10个折叠,折叠间由α螺旋连接,共有12个螺旋。氨基酸序列和结构分析显示GS蛋白包含了一个GS beta-Grasp domain和一个GS catalytic domain,这些功能区在植物的谷氨酰胺合成酶中是保守的,均为Gln-synt结构域。不同氮形态比例的氮源对GS1和GS2基因表达的影响规律和GS活性变化规律基本一致。NO3--N:NH4+-N=80:20和NO3--N:NH4+-N=50:50的处理最能促进GS基因的表达,NO3--N:NH4+-N=0:100对GS基因诱导作用最差。即混合态氮有利于甜菜GS基因的表达,单一种类的氮作用较差,而单一硝态氮则较单一铵态氮好。经过氮素诱导后,不同放线菌素D和放线菌酮对GS1和GS2基因表达的影响规律和GS活性变化规律基本一致。放线菌素D抑制了氮素诱导后甜菜GS基因的表达和GS活性,放线菌酮抑制了GS活性,但GSmRNA的相对表达量有所增加。说明氮素对甜菜GS基因诱导的表达在转录和翻译水平上受到调控,并且也体现在酶活性水平上。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 高等植物的氮素营养
• 1.2.1.1 氮素在高等植物中的生理功能
• 1.2.1.2 植物对氮素的吸收
• 1.2.2 植物谷氨酰胺合成酶的研究现状
• 1.2.2.1 植物谷氨酰胺合成酶的结构及分布
• 1.2.2.2 植物谷氨酰胺合成酶基因分子生物学研究现状
• 1.2.2.3 植物谷氨酰胺合成酶表达调控研究现状
• 1.2.3 植物基因克隆技术研究现状
• 1.2.4 谷氨酰胺合成酶的生物信息学研究现状
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试品种
• 2.1.2 主要分子和生化试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 试验设计
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 试验研究方法
• 2.2.2.1 基因克隆及序列分析
• 2.2.2.2 基因的表达分析
• 2.2.3 试验技术路线
• 2.3 主要试验方法
• 2.3.1 GS1 和GS2 cDNA 的克隆及序列分析
• 2.3.1.1 实验材料甜菜的用前准备
• 2.3.1.2 甜菜叶片总RNA 的抽提
• 2.3.1.3 甜菜总RNA 的电泳检测
• 2.3.1.4 RNA 的消化，去除DNA（参照DNaseⅠ的说明书）
• 2.3.1.5 RNA 的定量及完整性分析
• 2.3.1.6 反转录合成cDNA 的第一链（参照SuperScriptⅢ反转录酶的使用说明书）
• 2.3.1.7 用RT-PCR 的方法获得G51mRNA 编码区片段
• 2.3.1.8 用RT-PCR 的方法获得G52mRNA 编码区片段
• 2.3.1.9 G51mRNA 和G52mRNA 片段的胶回收（参照TaKaRa 胶回收纯化试剂盒的说明书）
• 2.3.1.10 目的片段与载体的连接与转化
• 2.3.1.11 阳性重组子的蓝白斑筛选及培养
• 2.3.1.12 质粒DNA 提取
• 2.3.1.13 载体中插入片段PCR 鉴定
• 2.3.1.14 测序
• 2.3.1.15 分子生物学分析
• 2.3.2 GS2 基因组DNA 的克隆及序列分析
• 2.3.2.1 供试品种用前准备
• 2.3.2.2 采取CTAB 法提取基因组DNA
• 2.3.2.3 基因组DNA（gDNA）的完整性分析
• 2.3.2.4 GS2 gDNA 5′end 的PCR 扩增.
• 2.3.2.5 GS2 gDNA 3′end 的PCR 扩增
• 2.3.2.6 GS2 gDNA 全长的PCR 扩增
• 2.3.2.7 PCR 产物的回收
• 2.3.2.8 连接与转化
• 2.3.2.9 阳性重组子的蓝白筛选及培养
• 2.3.2.10 质粒DNA 提取
• 2.3.2.11 载体中插入片段双酶切验证
• 2.3.2.12 载体中插入片段PCR 鉴定
• 2.3.2.13 测序
• 2.3.3 氮素对甜菜GS 活力及基因表达的影响
• 2.3.3.1 GS 活力的测定（参照李彩凤，2003）.
• 2.3.3.2 甜菜叶片总RNA 提取和检测
• 2.3.3.3 反转录（RT）合成cDNA
• 2.3.3.4 半定量PCR 反应
• 2.3.4 氮素诱导后放线菌素D 和放线菌酮对甜菜GS 活力及基因表达的影响
• 2.3.4.1 GS 活力的测定
• 2.3.4.2 甜菜叶片总RNA 提取和检测
• 2.3.4.3 反转录（RT）合成cDNA
• 2.3.4.4 半定量PCR 反应
• 3 结果与分析
• 3.1 甜菜GS1CDNA 和GS2CDNA 基因的克隆
• 3.1.1 甜菜总RNA 的提取及检测
• 3.1.2 GS1cDNA 和GS2cDNA 基因的获得
• 3.1.3 GS1cDNA 和GS2cDNA 基因的生物信息学分析
• 3.1.3.1 蛋白质的同源性检索及系统发生进化树分析
• 3.1.3.2 GS1 和GS2 编码蛋白一级结构序列分析
• 3.1.3.3 GS1 和GS2 蛋白质的二级结构预测
• 3.1.3.4 GS1 和GS2 蛋白质的立体结构预测
• 3.1.3.5 GS1 和GS2 蛋白质的功能结构域分析
• 3.2 甜菜GS2 DNA 基因的克隆
• 3.2.1 甜菜总DNA 的提取及检测
• 3.2.2 GS2DNA 基因的获得.
• 3.3 甜菜GS 基因的表达分析
• 3.3.1 氮素对甜菜GS 基因表达的影响
• 3.3.1.1 不同氮素处理下甜菜叶片GS 活性的变化
• 3.3.1.2 不同氮素处理下甜菜叶片GS1mRNA 的变化
• 3.3.1.3 不同氮素处理下甜菜叶片GS2mRNA 的变化
• 3.3.2 氮素诱导后核酸与蛋白合成抑制剂对甜菜GS 基因表达的影响
• 3.3.2.1 经氮素诱导后放线菌素D 处理甜菜叶片GS 活性的变化
• 3.3.2.2 经氮素诱导后放线菌酮处理甜菜叶片GS 活性的变化
• 3.3.2.3 经氮素诱导后放线菌素D 处理甜菜叶片GS1m RNA 的变化
• 3.3.2.4 经氮素诱导后放线菌素D 处理甜菜叶片GS2m RNA 的变化
• 3.3.2.5 经氮素诱导后放线菌酮处理甜菜叶片G51mRNA 的变化
• 3.3.2.6 经氮素诱导后放线菌酮处理甜菜叶片G52mRNA 的变化
• 4 讨论
• 4.1 甜菜GS 基因的克隆
• 4.1.1 甜菜的诱导处理及RNA 的提取
• 4.1.2 甜菜GS 基因及克隆方法
• 4.2 甜菜GS 的生物信息学分析
• 4.3 甜菜谷氨酰胺合成酶基因的表达分析
• 4.3.1 氮素对甜菜GS 基因表达的影响
• 4.3.2 氮素诱导后核酸与蛋白合成抑制剂对甜菜GS 基因表达的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文