GPR40与β细胞脂毒性的关系及吡格列酮干预作用研究

论文摘要

游离脂肪酸（FFAs）短期干预可促进β细胞分泌胰岛素,长期干预抑制β细胞的功能。研究发现FFAs受体G蛋白偶联受体40（GPR40）能介导胰岛素分泌,在2型糖尿病的病理生理机制中起重要作用。尽管进行了许多研究,目前GPR40的生物学功能还未完全清楚。为了对GPR40有更加深入的认识,本研究探讨GPR40是否介导FFAs对胰岛β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）的短期和长期影响;是否介导FFAs对β细胞胰-十二指肠同源盒基因-1（PDX-1）和葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）表达的影响,以及是否参与吡格列酮对胰岛β细胞脂毒性的干预作用。本研究第一部分构建稳定表达GPR40shRNA的βTC6细胞株。首先设计合成两对含GPR40shRNA的寡核苷酸模板链,连接入线性pSilencer4.1-CMV neo siRNA表达载体,并测序鉴定。脂质体法把载体转染至βTC6细胞,通过G418筛选得到稳定转染的βTC6细胞株。RT-PCR和western blot检测细胞GPR40 mRNA和蛋白的表达情况。结果显示成功构建了GPR40 shRNA重组质粒,转染重组质粒pSilencer-GPR40shRNA的βTC6细胞GPR40 mRNA和蛋白表达比对照组显著降低,建立了持续低表达GPR40的βTC6细胞株。本研究第二部分旨在探讨GPR40是否介导FFAs和吡格列酮作用下βTC6细胞的GSIS。分别以不同浓度FFAs（0.25、0.5或1 mmol/L,油酸与棕榈酸的比例为2:1）或/和吡格列酮（0.1、1或10μmol/l）干预细胞1小时或48小时。结果显示,FFAs干预一小时,阴性对照组的GSIS显著增加,但转染GPR40shRNA的细胞GSIS未见明显增加。FFAs干预48小时后,GPR40shRNA细胞与阴性对照组GSIS均显著下降。吡格列酮与FFAs共同干预48小时,阴性对照组GSIS较FFAs干预48小时显著增加,但GPR40shRNA组未见显著变化。本研究第三部分探讨FFAs是否通过GPR40影响βTC6细胞PDX-1和GLUT2的表达,吡格列酮对脂毒性的保护作用是否通过GPR40的介导而影响βTC6细胞PDX-1及GLUT2的表达。分别以0.5 mmol/L FFAs干预1小时或48小时,或0.5 mmol/L FFAs与10μmol/l吡格列酮共同干预细胞48小时。结果显示,FFAs干预1小时显著增加阴性对照组PDX-1和GLUT2的表达,而转染GPR40shRNA的细胞PDX-1和GLUT2的表达未见明显增加。FFAs干预48小时后,转染GPR40shRNA的细胞与阴性对照组PDX-1和GLUT2的表达均下降。吡格列酮与FFAs共同干预48小时,阴性对照组PDX-1和GLUT2的表达较FFAs干预48小时显著增加,但GPR40shRNA组未见显著变化。综合上述结果,GPR40介导了FFAs短期作用下β细胞GSIS的增加以及PDX-1和GLUT2表达的上调,但未介导FFAs的慢性脂毒性作用。而吡格列酮对β细胞脂毒性的改善则可能部分通过GPR40的作用增加PDX-1和GLUT2的表达,从而改善GSIS。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分： GPR405hRNA 表达载体构建及其稳定转染βTC6 细胞系的建立
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分：稳定转染GPR405hRNA 对游离脂肪酸及吡格列酮干预βTC6 细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分：稳定转染 GPR405hRNA 对游离脂肪酸及吡格列酮干预βTC6 细胞PDX-1、GLUT2 表达的影响
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录一 英文缩略词表
• 附录二 试剂配方
• 致谢
• 在校期间发表的论文情况