论文摘要
本论文包括文献研究和实验研究两个部分。文献研究通过大量的文献资料,系统回顾了雪旺细胞体外培养的方法,并对重组腺病毒表达载体和脑源性神经营养因子的研究进展进行总结和分析。通过分析既往雪旺细胞体外培养和基因转染方法中存在的主要问题,设想将编码神经营养因子的基因片断通过腺病毒载体导入雪旺细胞即可以实现目的基因的持续、稳定表达,探索基因治疗外周神经损伤的新途径。周围神经损伤后的修复与再生是多因子、多因素参与的生理过程,补充单一因子对神经再生的作用非常有限。周围神经损伤症状属于祖国医学中的痿症和痹症,且中药正是一种多因素复合物,有可能提供更多、比例更接近神经生理需求与生长活性因子的环境,有其独特优势,此实验的成功为日后结合传统中医的整体观促进神经损伤的恢复提供了良好的基础。实验研究目的：通过联合运用多种方法在短时间内获得数量多、纯度高的雪旺细胞,用携带脑源性神经生长因子基因的重组腺病毒载体转染雪旺细胞。探讨应用重组腺病毒载体携带脑源性神经生长因子基因转染雪旺细胞的可行性及促进外周神经损伤恢复的有效途径。方法：采取6-7 d SD乳鼠坐骨神经,利用酶消化法、差速贴壁法分离获得雪旺细胞、Ara-C与G418联合应用以去除成纤维细胞、牛脑垂体提取物（BPE）以促进雪旺细胞增殖,以及采用低浓度胰酶消化法传代等一系列步骤,获取大量高纯度的雪旺细胞。为探讨BPE对体外培养雪旺细胞增殖作用的影响以及确定BPE应用的最佳浓度,将第二代雪旺细胞分为五组,分别加入不同浓度的BPE（50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml）,并以不加BPE作为对照。在加入BPE后于第二、四、六、八天每组分别作S-100蛋白相关抗原免疫细胞化学染色,对雪旺细胞、成纤维细胞分别计数,进行统计学分析。将重组腺病毒载体感染HEK293细胞,待CPE现象明显时采用反复冻融法收获病毒,然后将收获的病毒再次感染HEK293细胞,收获病毒,重复三次。对最后一次收获的病毒采用噬斑检测法（plaque assay）进行滴度测定。使用含有人BDNF基因的重组腺病毒载体,经不同感染复数（multiplicity of infection, MOI）病毒量感染体外培养的大鼠源性SC。RT-PCR和Western blot检测感染后72 h的感染效率,进一步用高感染效率下的MOI病毒量感染SC, ELISA定量分析感染后3d、6d、9d、12d、15d、18d和21d时在感染后SC培养液上清中BDNF的表达。结果：经形态学及S-100蛋白相关抗原免疫细胞化学染色鉴定证实所获得的雪旺细胞状态较好,纯度较高,可达90%以上。BPE对雪旺细胞有明显促增殖作用；当BPE浓度为100μg/ml时,对成纤维细胞分裂影响较小同时对雪旺细胞保持了有效的促增殖作用。三轮病毒扩增后Ad-BDNF滴度为：1.78×109pfu/ml。重组腺病毒感染SC后72 h时,以MOI为200感染组的感染效率最高。进一步以MOI为200的病毒量感染SC,ELISA结果表明,在各时间点时,感染后SC培养液上清中的BDNF表达量均明显高于正常SC。结论：通过将酶消化法、差速贴壁法、Ara-C与G418、BPE及低浓度胰酶消化法联合运用可以在短时间内获得纯度高、状态好的原代培养雪旺细胞。适当浓度的牛脑垂体提取物（BPE）可以有效的促进雪旺细胞增殖。使用HEK293细胞扩增腺病毒载体可以在短时间内获得高滴度的腺病毒载体。Ad-BDNF感染后SC能够将重组腺病毒介导的外源性BDNF基因通过转录翻译,最终表达的BDNF量高于正常SC,并且能够维持较长时间。此为应用重组腺病毒载体携带脑源性神经生长因子基因转染雪旺细胞促进损伤神经修复奠定了实验基础,探索了基因治疗外周神经损伤的新途径。
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相关论文文献
- [1].CNTF和Ad-BDNF对视神经夹伤后视网膜神经节细胞存活的影响[J]. 国际眼科杂志 2008(06)